LC-MS分析以及来自Flemingia faginea原始栖息地和离体培养标本的提取物的血管舒张作用：内皮细胞和钙通道的作用

《Phytomedicine Plus》：LC-MS analysis and vasorelaxant effect of extracts from original habitat and ex-situ reproduced specimens of Flemingia faginea: roles of the endothelium and calcium channels

　　Fédé Aristhide Soulama | Maurice Ouédraogo | Abdoulaye Yougoubo | Tanga Ouaré | Essohanam Jean Webiké-Mindamou | Fran?ois Yougbaré | Francis Ousmane Konaté | Rémy Kindanloun Bationo | Ignace Diendéré | Martin Kiendrebeogo
动物生理学实验室（LAPA），Joseph Ki-Zerbo大学，09 BP 848，瓦加杜古09，布基纳法索

**摘要**
Flemingia faginea的叶子被用于治疗高血压。本研究比较了从异地繁殖样本（AEFf-ex）和原始栖息地样本（AEFf-or）中提取物的血管舒张活性和植物化学成分。通过使用完整内皮和去内皮的大鼠主动脉环、受体拮抗剂、通道阻滞剂和酶抑制剂来确定AEFf-or效应的机制。AEFf-or和AEFf-ex的LC–MS色谱图在质量上相似，表明它们的多酚成分相当。粗提物（浓度为3×10^-3至3 mg/mL）能够依赖浓度地使预先用苯肾上腺素（EC50：0.34 ± 0.06 mg/mL）或KCl（80 mM）预收缩的主动脉平滑肌放松（EC50：0.85 ± 0.12 mg/mL）。在阿托品或亚甲蓝存在下，这种放松作用被延迟，这表明eNOS/NO/sGC/cGMP信号通路可能参与了这一过程。在吲哚美辛存在下，AEFf-or引起的放松作用减弱，进一步支持了内皮来源因子的作用。茶碱（TEA）也减弱了AEFf-or引起的放松作用。AEFf-or使Ca2+累积浓度-反应曲线向右移动，表明钙的动员可能发生了变化，这可能是由于其对钙通道的直接作用。AEFf-or的效果与钙通道阻滞剂维拉帕米相似。在AEFf-or存在下，苯肾上腺素或KCl的浓度-反应曲线向下移动。AEFf-or可能通过影响细胞内储存的钙释放来发挥作用，因为它能在无钙培养基中降低苯肾上腺素的收缩反应。结果表明，AEFf通过减少离子通道或细胞内储存的钙释放来产生血管舒张作用。

**1. 引言**
血管活性是影响血压的一个因素。其稳态依赖于Windkessel效应，该效应有助于减少高血流。动脉退化和疾病是心血管死亡和残疾的主要原因（Herzog等人，2025年）。高血压的发病机制是多因素的，但其病因可能归因于生理老化、与非传染性疾病（NCDs）相关的心血管病理刺激（如糖尿病、肥胖和肾衰竭）以及其他次要风险因素（Tang等人，2021年）。恢复正常血压是一个涉及心脏和血管协同作用的多方面过程（Niiranen等人，2016年）。尽管接受了治疗，大多数高血压患者的血管仍然僵硬，这突显了潜在病理生理学的复杂性。血管功能障碍可能与内皮来源的舒张因子（EDRF）的缺乏有关。这可能是由于内皮一氧化氮合酶（eNOS）活性降低所致，因为eNOS通过eNOS/NO/sGC/cGMP信号通路刺激一氧化氮（NO）的产生；或者可能是由于环氧化酶（COX）催化的前列腺素I2（PGI2）信号通路的作用。毛果芸香碱M3受体与Gαq蛋白的结合激活磷酸脂酶C通路也被证明可以诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）的收缩（X. Liu等人，2024年）。通过激活离子通道增加Ca2+流入也可以诱导血管收缩（Brozovich等人，2016年）。因此，针对内皮信号通路和钙依赖性通路可能是开发有效抗高血压疗法的核心方法。这些血管靶点正在被研究，以寻找副作用最小的治疗分子（Darchy，2017年；Tang等人，2021年）。鉴定多靶点生物活性化合物对于实现动脉高血压管理的协同效应至关重要。在寻找具有血管活性的植物来源物质时，原产于西非的Flemingia faginea在传统实践中被用于抗高血压（Thiombiano等人，2012年）。植物化学研究已经鉴定出多种次级代谢物，如多酚、黄酮类、单宁、皂苷和萜类（Soicke等人，1990年；Ouedraogo等人，2023年）。这些植物化学物质通常与血管效应有关，特别是通过与一氧化氮信号通路和钙处理的相互作用。然而，其血管舒张效应的确切机制尚未充分阐明。人们对这种植物的兴趣超出了其药理潜力。它的分布相对有限，主要局限于保护区的永久性水道中，这限制了当地人口的获取。因此，人们尝试通过种子和插条繁殖这种植物以增加其可用性（Gnoumou等人，2021年）。在体外研究其作用机制时，使用离体组织或器官并在接近生理条件下进行实验是药理学、生理学和药物开发中的关键步骤。对于经典的血管药理学研究，大鼠主动脉因其实用、机械和生理可重复性而成为理想选择。因此，本研究的目的是确定Flemingia faginea水提取物（AEFf）在分离的大鼠胸主动脉中引起的血管舒张机制，特别关注内皮参与和钙依赖性通路。此外，还比较了来自原始栖息地（AEFf-or）和异地繁殖（AEFf-ex）样本的水提取物的血管舒张效应和植物化学成分。

**2. 材料与方法**
2.1. 生物材料和提取
从布基纳法索的Kaboré Tambi国家公园（原始栖息地）和国家级森林种子中心（通过插条异地繁殖）收集了带叶的小枝。该样本编号为18010，参考样本（编号6972）存放在Joseph KI-ZERBO大学植物生物学和生态学实验室的标本馆中。将叶粉煎煮（1克/10毫升蒸馏水，煮沸几分钟），冷却后过滤，离心（2000转/分钟15分钟），并将上清液在通风烤箱中40°C下干燥48小时。最终水分含量（5.79%至5.82%）通过称重法确认。实验使用的是在标准实验室条件下饲养的18周龄Wistar大鼠（约240克）。

2.2. 药物和化学品
本研究使用了Sigma Aldrich实验室提供的乌拉坦、盐酸苯肾上腺素、氯化乙酰胆碱、盐酸维拉帕米、亚甲蓝水合物、吲哚美辛、阿托品、乙二胺四乙酸（EDTA）和四乙胺（TEA）。

2.3. HPLC-MS/MS分析
分析是在Agilent 1290 Infinity II系统上进行的，该系统连接了Agilent 6545质谱仪（LC-Q-TOF-MS），采用电喷雾离子化技术。提取物（1毫克/毫升甲醇）在注射前经过0.45微米过滤器过滤。分离使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱，以水（0.1%甲酸，A）和乙腈（B）的二元梯度进行，流速为0.4毫升/分钟。注射体积为0.5微升；柱温为25°C（Z. Liu等人，2024年）。质谱采集在正ESI模式下进行，m/z范围为100-1000，毛细管电压为3500伏，碎片电压为175伏，用于检测[M+H]离子。化合物的鉴定结合了观察到的m/z值、MS/MS碎片模式、NIST数据库的比较以及类似化合物的文献数据。由于缺乏真实的参考标准，并且使用的是标称分辨率的LC-ESI-MS，这些鉴定结果应视为初步的。不同条件下生长的植物的提取物的比较植物化学分析基于色谱图的质量相似性。

2.4. 分离的大鼠主动脉环
在乌拉坦（15%）麻醉后（1毫升/100克体重），收集胸主动脉，用Krebs-Heinseleit溶液（pH 7.4；mM：NaCl 118.50，NaHCO3 25，KCl 4.75，MgSO4-7H2O 1.19，CaCl2-2H2O 1.36，KH2PO4 1.18，葡萄糖11.10）冲洗并去除粘连。将器官切成3-5毫米的环，置于37°C的浴液中含10毫升KHS中，并进行氧合。在45分钟内施加2克的基线张力以稳定。通过乙酰胆碱（1微摩尔）诱导的松弛（-80%）在预先用苯肾上腺素（1微摩尔）预收缩的环上确认了功能性内皮的存在（Benajiba等人，2006年）。通过机械去内皮的环中缺乏乙酰胆碱诱导的松弛（<10%）验证了内皮的去除。所有环在添加测试物质前都达到了≥2克的张力。添加的体积从未超过浴液体积的1%，符合Van Rossum的建议（Van Rossum & Van den Brink，1963年）。

2.5. 实验方案
2.5.1. AEFf-or和AEFf-ex的血管效应研究
来自不同个体的主动脉环用苯肾上腺素（1微摩尔）或KCl（30或80毫摩尔）预收缩。在达到收缩后，以累积浓度（3×10^-3至3毫克/毫升）添加两种类型的AEFf。也在无内皮的环上测试了AEFf-or的效果。维拉帕米（3×10^-3至3×10^2微摩尔）作为阳性对照。

2.5.2. 膜受体和内皮介质的作用评估
在用苯肾上腺素（1微摩尔）或KCl（80毫摩尔）预收缩之前，将环与酶抑制剂共孵育45分钟，然后累积添加AEFf-or（3×10^-3至3毫克/毫升）。使用了一氧化氮合酶抑制剂（亚甲蓝，10微摩尔）、环氧化酶（COX）抑制剂（吲哚美辛，2微摩尔）和毒蕈碱M3受体拮抗剂（阿托品，1微摩尔）。

2.5.3. AEFf-or中钙的作用评估
在富含钾的无Ca2+的Krebs溶液中（mM：KCl 50，NaCl 50.58，MgSO4 3.1，NaHCO3 23.8，KH2PO4 1.26，葡萄糖11.1，EDTA 0.1，pH 7.4）评估VSMCs钙通道的参与。将完整的内皮环或去内皮的环在正常Krebs溶液中稳定30分钟，然后更换为无Ca2+的溶液（45分钟），接着在富含Ca2+的无Ca2+溶液中去极化（45分钟）。在预先用0.25和0.75毫克/毫升AEFf-or孵育的环上，添加逐渐增加的Ca2+（10^-5至3×10^-2摩尔）以获得累积浓度-反应曲线。为了比较，在含有乙二胺四乙酸（EDTA）（0.1毫克）的无Ca2+的Krebs溶液中，测试了添加AEFf-or对苯肾上腺素（10^-6摩尔）峰的影响（Khan等人，2012年）。

2.5.4. K+通道在AEFf-or血管效应中的作用评估
在添加AEFf-or之前，将环与四乙胺（TEA）（10毫克，45分钟）共孵育（Tang等人，2021年）。

2.5.5. 统计分析
所有数据以平均值±标准误差（n=6）表示。使用GraphPad Prism版本5.03（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。浓度-反应曲线通过四参数逻辑模型进行非线性拟合，以确定EC50值。使用双因素方差分析（ANOVA）比较多个组。当多个实验组与单个对照组比较时，应用Dunnett的事后检验。对于选定的成对比较，使用Bonferroni多重比较检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。

**3. 结果**
3.1. 通过HPLC-MS/MS初步鉴定化合物
从图1中的色谱峰（保留时间在0到28分钟之间）尝试鉴定出24种化合物。提出的代谢物包括黄酮醇、黄烷醇、羟基肉桂酸、羟基苯甲酸、花青素、生物碱和萜类（表1）。

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**图1. AEFf-or和AEFf-ex的LC-MS ESI+色谱图。** 黑色扫描：AEFf-or；红色扫描：AEFf-ex。
**表1. LC-MS分析后两种提取物鉴定出的代谢物比较。**
| 峰号 | Rt（分钟） | [M-H] | +（m/z） | 暂定鉴定或推断的化合物 | 分类 | MW | 名称 | 公式 |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 10 | 6.10 | 27.22 | 62.65 | Myricetin 3-rhamnoside-3′-glucoside | C27H30O17+ | 黄酮醇苷 | |
| 29 | 7.15 | 197.14 | 196.20 | Dihydroferulic acid | C10H12O4+ | 羟基肉桂酸 | |
| 31 | 10.24 | 333.23 | 332.26 | 6-O-Galloyl-B-D-glucose | C13H16O10+ | 羟基苯甲酸 | |
| 41 | 10.65 | 347.21 | 346.28 | Syringetin | C17H14O8+ | 甲基化黄酮醇 | |
| 51 | 11.06 | 711.44 | 361.22 | Syringic acid-4-D-glucopyranoside | C15H20O10+ | 羟基苯甲酸苷 | |
| 71 | 12.22 | 144.33 | 443.6 | Yibeissine | C27H41NO4+ | 生物碱 | |
| 81 | 12.51 | 912.79 | 912.79 | 1013.15 | 4NINI+ | |
| 11 | 13.53 | 1NINI+ | 1220.72 | 5833, 4183 | 2 | Quercetin-O-sinapoyl-glucoside-O-glucoside | |
| 13 | 22.56 | 579,225 | 78.52 | Vitexin 2-0-rhamnoside | C27H300 | 14+ | 三羟基黄酮 | |
| 14 | 23.20 | 0517.32 | 516.45 | 3,5-Dicaffeoylquinic acid | C25H240 | 12+ | 酚酸 | |
| 15 | 23.38 | 9318.33 | NI+ | 1623.55 | 579.25 | Vitexin 2-0-rhamnoside | |
| 17 | 23,77 | 7207.13 | 206.19 | Acetyl-p-coumaric acid | C11H10O4+ | 酚酸 | |
| 18 | 24.22 | 1527.34 | 526.49 | Salcolin BC | C27H260 | 11+ | 黄酮木脂素 | |
| 19 | 24.38 | 8389.23 | 88.3 | Betanidin | 2024.47 | 7387.22 | Betalain | |
| 20 | 24.47 | 7387.22 | 86.31 | -O-synapoyl-beta-D-glucose | C17H22O10+ | 葡萄糖基羟基肉桂酸 | |
| 21 | 25.45 | 4NI+ | 2225.56 | 5565.37 | 564.5 | Kaempferol 3-Xylosyl- (1-2)- rhamnoside | C26H28O14+ | 黄酮醇苷 | |
| 23 | 26.14 | 2453.22 | 4524.52 | Epicatechin-3-0-glucoside | C21H240 | 11+ | 黄酮醇苷 | |
| 24 | 27.03 | 5555 | 5455 | Pentacyclic terpenoid | C38H660 | 2+ | 萜类 | |

**图例：** Rt：保留时间；Or：原始栖息地；Ex：异地栖息地；NI：未鉴定；+：存在。

3.2. AEFf-or和AEFf-ex在KCl或苯肾上腺素诱导收缩后的血管舒张效应
图2A展示了AEFf-or的典型血管舒张效应记录。使用与测试化合物相同体积的蒸馏水（溶剂）进行累积添加并未对预先用苯肾上腺素（1微摩尔）预收缩的主动脉环产生任何显著变化（图2B）。AEFf-or完全放松了预先用苯肾上腺素（1微摩尔）或KCl（80毫摩尔）预收缩的主动脉（3.103微克/毫升，图2；表2，表3）。当这些环预先用1微摩尔苯肾上腺素（EC50：1.34 vs. 0.34毫克/毫升，p < 0.001；图2，C）或80毫摩尔KCl（EC50：1.17 ± 0.24 vs. 0.85 ± 0.12毫克/毫升，p < 0.001；图2，D）预收缩时，无内皮的环的放松曲线显著向右移动。预先用80毫摩尔KCl预收缩的环的EC50值远高于预先用30毫摩尔KCl预收缩的环（0.35 ± 0.07毫克/毫升，图2，E）。有内皮的环的最大放松值（分别为108.10 ± 7.62%和100.89 ± 15.23%，在用苯肾上腺素和KCl预收缩后）高于无内皮的环（分别为94.53 ± 20.31%和82.37 ± 14.45%，表2，表3）。提取物的松弛曲线与维拉帕米（Figure 2, F）的曲线相似。AEFf-ex能够松弛由苯肾上腺素或KCl（80 mM）预先收缩的血管环（Emax分别为97.13 ± 7.64%和97.10 ± 23.99%）。在苯肾上腺素预先收缩的血管环中，与AEFf-or相比，累积浓度-反应曲线出现了轻微的向右移动（Figure 3A）。然而，AEFf-ex和AEFf-or的EC50值没有显著差异。相比之下，在KCl预先收缩的血管环中，AEFf-ex和AEFf-or的浓度-反应曲线基本重合（Figure 3B）。槲皮素、山柰酚和表儿茶素能够激活钙依赖性的钾通道（KCa），尤其是BKCa，从而导致膜超极化，并随后关闭电压依赖性的Ca2?通道（Tang等人，2021年）。此外，酚类化合物和萜类物质可能通过调节环腺苷cAMP/PKA信号通路以及K+/Ca2?通道来发挥作用（Demirel，2024年）。本研究中观察到的药理特性似乎与上述机制一致。然而，由于成分的初步鉴定尚不准确，因此无法将这种活性直接归因于某一特定化合物。Flemingia faginea的血管舒张作用与其他富含多酚的植物提取物所报道的效果相符。例如，来自Vitis vinifera的多酚已被证明可以刺激PI3K/Akt/eNOS信号通路，同时限制血管平滑肌细胞中的Ca2?流入（Oak等人，2018年）。对于Camellia sinensis和Hibiscus sabdariffa的研究也表明类似的机制，即血管舒张涉及内皮细胞的调节和钙通道的抑制（Venkatesan等人，2026年）。

**5. 结论**
本研究表明，Flemingia faginea的水提取物可能具有浓度依赖性的血管舒张作用，这一过程可能涉及内皮细胞和血管平滑肌。整体反应模式表明其作用机制是通过调节钙离子动态来实现的，其中内皮细胞信号传导至少起到部分作用。然而，确切的活性成分及其具体的分子靶点尚未确定。需要进行定量分析以确认AEFf与AEFf-ex之间的潜在差异。在这方面，未来结合靶向代谢组学分析、计算机模拟（如分子对接、分子动力学模拟和网络药理学分析）的研究，有助于预测这些初步鉴定出的多酚与关键血管靶点（包括L型Ca2?通道、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和钾通道）之间的相互作用。这些发现为F. faginea的血管活性提供了科学依据，并支持进一步的机制研究、体内实验和计算机模拟分析。

**伦理委员会批准**
提交给伦理委员会的实验方案已获得CE-UJKZ/2022-10号的批准。

**作者贡献声明**
Fédé Aristhide Soulama：概念设计、方法学制定、实验设计、资金获取、初稿撰写、数据分析。
Maurice Ouédraogo：概念设计、方法学制定、资金获取、实验监督、结果验证及修订编辑。
Abdoulaye Yougoubo：实验设计、数据分析。
Tanga Ouaré：方法学制定、实验设计、数据分析。
Essohanam Jean Webiké-Mindamou：实验设计。
Fran?ois Yougbaré：实验设计。
Fran?ois Ousmane Konaté：实验设计。
Rémy Kindaloun Bationo：实验设计、数据分析、结果验证。
Ignace Diendéré：实验设计。
Martin Kiendrebeogo：概念设计。

**资金支持**
本研究得到了布基纳法索高等教育、研究与创新部（MESRI）的“高等教育支持项目（PAES）”的资助。

**利益冲突**
无。

**数据可用性**
数据可应要求提供。

**关于手稿制备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明**
在撰写本文期间，作者使用了ChatGPT工具进行语言编辑和提升文章可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和修改，并对最终发表的文章内容负全责。

**作者贡献声明**
Fédé Aristhide Soulama：初稿撰写、方法学制定、实验设计、资金获取、数据分析、概念设计。
Maurice Ouédraogo：修订编辑、结果验证、实验监督、方法学制定、资金获取、概念设计。
Abdoulaye Yougoubo：实验设计、数据分析。
Tanga Ouaré：实验设计。
Essohanam Jean Webiké-Mindamou：实验设计。
Fran?ois Yougbaré：实验设计。
Fran?ois Ousmane Konaté：实验设计。
Rémy Kindaloun Bationo：结果验证、实验设计、数据分析。
Ignace Diendéré：实验设计。
Martin Kiendrebeogo：概念设计。