热带森林中真菌群落对人为干扰的响应

《Plant-Environment Interactions》：Response of Fungal Communities to Anthropogenic Disturbances in a Tropical Forest

　　**摘要**

将森林转化为农业用地会导致土壤生物多样性的下降，并影响其所提供的生态系统服务。肯尼亚山森林周边人口的增长以及对土地和森林资源需求的增加导致了森林砍伐。然而，这种变化对真菌群落的影响尚不清楚。本研究使用高通量测序技术评估了肯尼亚山森林保护区内（主要为林地）和未受保护地区（以灌木丛为主）的真菌多样性。在林地中，数量最丰富的真菌属分别是Mortierella（23.3%）和Metarhizium（5.4%）；而在灌木丛中，Fusarium（8.5%）和Aspergillus（3.5%）的数量显著更高。对主要生活方式的评估显示，林地中的动物寄生菌（16.3%）和土壤腐生菌（46.2%）的数量显著更多。β多样性分析表明，林地和灌木丛中的真菌群落存在明显差异。冗余性分析显示，Mortierella与锰（Mn）和碳（C）呈正相关，而Metarhizium和Aspergillus分别与粘土（Clay）和碳（C）呈负相关。这些结果为肯尼亚山森林中真菌群落的保护提供了重要信息，也有助于制定改善土壤健康的管理决策。

**1 引言**

全球陆地表面有30%被森林覆盖，森林储存了45%的碳（C）储量。森林通过吸收二氧化碳（CO2）排放来减缓气候变化。特别是热带森林，它们储存了大量的碳，约占陆地碳储量的25%（Bonan 2008）。森林在各种空间和时间尺度上都会受到自然和人为的干扰（Ratajczak等人2018）。在非洲，将森林转化为农田是森林减少的主要驱动因素（Masolele等人2024）。这些干扰影响了地上和地下生物的分布、数量和多样性，包括真菌群落，可能导致森林健康状况恶化（Gil-Fernández等人2025；Sapsford等人2021；Shi等人2019）。外生菌根（ECM）和丛枝菌根（AMF）与树木形成共生关系，在养分循环（Phillips等人2013）、树木养分吸收（Smith和Read 2010）、调节土壤生物的代谢活动（Steidinger等人2019）以及塑造植物群落多样性（Chen等人2019）中起着关键作用。尤其是ECM，它们依赖真菌获取水分和养分（Smith和Read 2010）。这些真菌对干扰非常敏感，恢复需要数年时间（Spake等人2016）。在大规模砍伐的森林中观察到ECM真菌物种丰富度下降和群落组成变化（Rianhard等人2025）。将热带森林转变为橡胶/油料种植园后，ECM真菌物种的数量减少（Brinkmann等人2019）。在喀麦隆，伐木和刀耕火种农业实践导致ECM几乎完全消失（Onguene 2022）。干扰还影响了森林中AMF的数量和多样性。例如，将森林转化为农田会降低AMF的多样性（Palta等人2025）。同样，人为干扰也会在干扰后降低森林中AMF的数量和多样性（Sapsford等人2021）。然而，另一项研究表明干扰可能会使AMF多样性趋于平衡（Garcia de Leon等人2018）。全球范围内，不到10%的菌根生物多样性热点位于保护区，这突显了协调保护工作的紧迫性，以实现《昆明-蒙特利尔全球生物多样性框架》的目标（Van Nuland等人2025）。非洲拥有大量ECM真菌，其数量和多样性差异很大（Corrales等人2018）。肯尼亚山森林生态系统是生物多样性的热点地区，其中一部分被列为世界遗产地，提供关键的生态系统服务（肯尼亚野生动物服务局2010）。对木材产品需求的增加加上气候变化导致肯尼亚山森林未受保护区域的大规模干扰（Rotich等人2025）。这些自然和人为压力威胁着森林健康（Millar和Stephenson 2015）和生物多样性，导致生态系统生产力和恢复力下降（P?rtner等人2023）。它们还影响了真菌的数量和群落组成（Corrales等人2018）。因此，了解干扰对森林生态系统中真菌的影响对于保护生物多样性和森林提供的生态系统服务至关重要。本研究调查了肯尼亚山森林保护区和未保护区内的真菌多样性。我们假设保护区的真菌数量和多样性会更高。本研究提供了可用于指导森林保护策略和恢复规划的基线信息。

**2 材料与方法**

**2.1 研究地点和样本采集**

2023年9月，在肯尼亚的肯尼亚山森林保护区（Irangi森林）和未保护区（Njukiri森林）采集了土壤样本。在Irangi森林（0°20′45.1″S 37°28′51.3″E）的15个地点采集样本，该地区受干扰较少，主要为林地；同时在未受保护的Njukiri森林（0°30′36.7″S 37°27′30.0″E）的15个地点也采集了样本，该地区受到人为干扰，主要为灌木丛。所有样本均获得了肯尼亚森林服务的许可。使用5厘米×10厘米的钻头从标记有两条样带的30米×30米区域内采集土壤样本，站点之间的距离为1公里。每个地点的样本被放入塑料袋中，并用冷藏箱运输到实验室。一部分土壤样本储存在-20°C用于DNA提取；其余样本则送往肯尼亚农业和畜牧业研究组织的国家农业研究实验室进行土壤性质分析。使用Mehlich等人（1962）的方法测定镁（Mg）、锰（Mn）、钾（K）、钙（Ca）、钠（Na）、磷（P）和pH值。碳（C）和氮（N）的水平分别通过比色法和凯氏消化法测定（Anderson和Ingram 1994；Bremner和Mulvaney 1982）。铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn）通过原子吸收光谱仪测定；土壤质地则使用比重计技术检测（Klute 1986）。根据肯尼亚气象部门的数据，采样地点的平均月温度和降水量分别为21.5°C和39.27毫米。

**2.2 DNA提取和测序**

按照制造商的说明，使用DNeasy Power Soil Pro Kit（Qiagen）从每个样本（250毫克）中提取DNA。空白管作为阴性对照。提取的DNA在后续分析前保存在-80°C。使用ITS3 ((正向): 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′/ITS4 (反向): 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)引物对ITS2区域进行扩增，PCR条件参考Op De Beeck等人（2014）的描述。具体步骤包括：95°C下初始变性2分钟，95°C下变性40个循环，55°C下退火30秒，72°C下延伸1分钟，最后在72°C下延伸10分钟。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上可视化，并使用Ampure XP珠子纯化后送至美国加州圣地亚哥的Scripps研究所进行文库制备和测序。使用NextSeq 2000（2×250bp）（Illumina Inc.，美国加州）进行双端测序。

**2.3 生物信息学和统计分析**

使用Lotus2管线（?zkurt等人2022）对真菌序列进行质量过滤、去多重化和去除嵌合体。处理后的OTUs通过vsearch与UNITE参考数据库（Nilsson等人2019）进行属和门的分类。使用R软件对生成的phyloseq对象进行进一步分析。在R中进行下游分析前，先去除单倍体和双倍体。使用FungalTraits数据库（P?lme等人2020）根据主要生活方式确定真菌属的生态类群。原始序列数据存储在BioProject编号PRJNA1186071的Sequence Read Archive中。所有统计分析均在R studio v 4.2.3中进行。非正态分布的数据使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验进行标准化，以满足正态性和同方差性假设。如果假设不成立，则使用Kruskal-Wallis检验，并在Benjamini-Hochberg校正后报告p值。通过计算基于丰度的覆盖估计值（ACE）、Fisher和Shannon多样性指数来比较两个生态系统中的真菌α多样性。使用置换多元方差分析（PERMANOVA，nperm=9999）分析森林生态系统的β多样性，并通过置换多元方差分析（PERMDISP）确定组间差异。使用主坐标分析（PCoA）根据Bray-Curtis距离矩阵可视化真菌的排序。方差分析（ANOVA）用于确定不同森林生态系统之间的土壤性质差异。方差膨胀因子（VIF）分析用于过滤共线性变量（VIF > 10）。使用冗余性分析（RDA）确定真菌群落与土壤理化性质之间的关系。使用基于置换的ANOVA（nperm=999）评估RDA模型的显著性。

**3 结果**

两个系统的总读数分别为5,357,490个，平均每个样本178,583个。灌木丛和林地的读数分别为2,594,219和2,763,271个。比较两个生态系统中的前20个最丰富的真菌属发现，林地中数量最丰富的属是Mortierella（23.3%）和Metarhizium（5.4%）；而在灌木丛中，Fusarium（8.5%）和Aspergillus（3.5%）的数量显著更高（图1）。林地中子囊菌门（Ascomycota）和Mortierellomycota（23.9%）是最丰富的门，而灌木丛中则以子囊菌门（Ascomycota）为主（75.4%）（图2）。对主要生活方式的评估显示，林地中的动物寄生菌（16.3%）和土壤腐生菌（46.2%）的数量显著更多。相反，灌木丛中植物病原菌的数量更多（20%）（图1）。图1显示了肯尼亚山森林未受保护和受保护林地中的前20个真菌属。图2显示了两个生态系统中真菌门的相对丰度。图3显示，两个生态系统中的α多样性指标存在显著差异（p<0.05），但Fisher和Shannon多样性指数没有差异。β多样性分析表明两个森林生态系统中的真菌OTUs有明显分离（PERMANOVA，p<0.001）。第一和第二PCoA轴分别解释了44.9%的总方差（图4）。图4显示了肯尼亚山森林未受保护和受保护林地中真菌的Shannon、Fisher和基于丰度的覆盖估计值（ACE）的差异。表1显示了除锰（Mn）和淤泥（Silt）外，所有土壤变量在两个生态系统中的差异。RDA分析显示Mortierella与锰（Mn）和碳（C）呈正相关，而Metarhizium和Aspergillus分别与粘土（Clay）和碳（C）呈负相关（图5）。第一和第二RDA轴分别解释了40.7%和2.5%的方差。

**4 讨论**

在森林生态系统中，真菌由于在生态系统功能中的核心作用而成为生物多样性的重要组成部分。干扰可能导致真菌群落的变化，从而影响森林健康。本研究中，林地中的Mortierella数量显著高于灌木丛。大多数Mortierella物种是内生菌或腐生菌，其中一些也被报道为病原菌（Crowther等人2012；Vélez等人2020）。林地中Mortierella物种的高丰度可能归因于与灌木丛相比，林地拥有更多的营养物质和更高的分解程度。Mortierella物种被认为是r-选择型生物，它们在有机物上生长迅速，并且在高营养条件下其数量会增加（Schmidt等人，2008年）。这种真菌通过其溶解磷酸盐的特性增加了植物对磷的吸收（Osorio和Habte，2013年）。研究表明，该属真菌可以作为线虫（DiLegge等人，2019年）和导致树木物种衰退的病原体的生物控制剂（Diez-Hermano等人，2024年）。另一方面，昆虫病原真菌Metarhizium也在未受干扰的森林中被发现，这与本研究的观察结果一致（Riguetti Zanardo Botelho等人，2019年）。Metarhizium通常与昆虫紧密相关（Deaver等人，2019年；J. Zheng等人，2024年），并且已知它可以通过抑制病原真菌来促进植物生长（Leger，2008年）。保护林地中Metarhizium的高丰度可能归因于低程度的干扰、丰富的昆虫宿主以及不同植物种类的存在，还有落叶层对土壤结构的改变，这些因素共同创造了有利于该真菌繁殖的环境（Jaronski，2010年；Klingen等人，2002年；C. Wang和St Leger，2007年）。未受保护的灌木丛中Fusarium的相对丰度较高，这与其他研究的观察结果一致（Cabello和Arambarri，2002年；Shi等人，2019年）。这种植物病原真菌会引起针叶树的幼苗病害和树脂溃疡病（Gordon等人，2015年；Landeras等人，2005年），以及某些树种的“Fusarium萎蔫病”（Mao等人，2021年；Zhao等人，2020年）。此外，本研究还观察到灌木丛中的子囊菌数量比保护林地更多，这与其他研究结果一致（Iacono等人，2025年；Koutika，2025年；Liu等人，2022年）。这可能是由于林地中的基质含有较高的木质素含量，而灌木丛中的基质较为易分解，后者是子囊菌更偏好的营养来源（Vo?í?ková和Baldrian，2013年）。此外，子囊菌能够承受较高的压力（Egidi等人，2019年）。灌木丛中的干扰可能促进了本研究中观察到的植物病原真菌数量的增加（Brinkmann等人，2019年；Fang等人，2023年；Shi等人，2019年）。Shi等人（2019年）还提出，病原真菌数量增加的其他可能原因包括灌木丛微气候条件的变化、缺乏腐生真菌的竞争，以及树木覆盖度的减少，这些因素促进了病原真菌孢子的传播。相反，我们在林地中观察到的高丰度土壤腐生真菌可能归因于不同分解阶段的各种树种提供的丰富基质（Pietras等人，2025年）、土壤性质的影响，或者林地中树木种类的多样性。土壤腐生真菌与高水平的有机物和氮含量呈正相关（Fang等人，2023年），它们在分解过程中起着关键作用，增加了碳含量并促进了植物生长（Talbot等人，2013年）。Shi等人（2019年）还观察到受干扰区域中腐生真菌的数量较少，并将其归因于干扰程度增加、土壤中磷含量高或土壤呈碱性。森林干扰也会影响真菌的alpha和beta多样性，自然森林的多样性更高（Brinkmann等人，2019年；Song等人，2019年）。与Osburn等人（2019年）的观察结果类似，干扰并未影响本研究中真菌的Shannon多样性，这可能是由于植物相关因素（Osburn等人，2019年）或未在此研究考察的环境因素（Mollier等人，2024年）的影响。然而，正如Modi等人（2020年）所报告的，我们观察到真菌群落的beta多样性存在明显差异。森林中真菌物种的丧失、植被类型的改变以及土壤pH值的变化可能是beta多样性差异的原因（Lan等人，2021年；Lladó等人，2018年；Sawada等人，2021年）。除了干扰因素外，树种、气候和土壤性质等其他因素也会影响森林中的真菌多样性（Fang等人，2023年；Pietras等人，2025年）。土地利用强度会影响土壤的物理化学性质，进而影响真菌多样性（Fang等人，2023年）。本研究显示土壤性质对真菌丰度有显著影响，第一和第二RDA轴分别解释了40.7%和2.5%的变异。第一轴的相对较高贡献表明土壤性质在真菌属丰度变化中占据了重要部分。相比之下，第二轴的较低贡献表明其他土壤变量解释了较少的变异，其他因素如干扰或未测量的环境变量可能解释了剩余的变异（Shi等人，2019年；Wang等人，2014年）。一项关于亚热带森林中真菌群落的研究表明，Mortierella物种存在于特定的土壤层中（Qu等人，2021年），并且它们与碳含量呈正相关（Luo等人，2021年），这与我们的观察结果一致。Metarhizium的分布和丰度也受到土壤性质的影响。与我们的结果相反，J. Zheng等人（2024年）指出，磷、铜和pH值是影响森林土壤中Metarhizium的主要土壤性质。同样，在热带森林中，Aspergillus与钾和铁呈负相关（Solanki等人，2024年），这与我们的观察结果相反。将森林转化为农业用地会改变土壤性质，导致Fusarium数量增加，并随之增加N2O排放（N. Zheng等人，2020年）。在本研究中，碳与钙之间的负相关以及Fusarium的丰度与Maina等人（2009年）的报告相反。除了上述因素外，季节和气候也在塑造真菌多样性方面起着关键作用（Casta?o等人，2018年；Shigyo等人，2019年；Vo?í?ková等人，2014年；M. Wang等人，2014年）。我们认识到这些是研究的局限性，但可以在未来的研究中加以探讨。

5 结论

我们的研究表明，肯尼亚山森林的保护区和未保护区具有不同的真菌多样性。受干扰的森林区域中病原真菌的数量也更高，这可能对森林健康构成威胁。这些发现为制定保护生物多样性的森林保护和立法提供了宝贵的依据，同时有助于实现《昆明-蒙特利尔全球生物多样性框架》的目标。它们进一步支持了优先考虑保护真菌多样性的森林管理策略的发展。总体而言，这突显了需要制定能够有效平衡农业需求与森林生物多样性及其提供的生态系统服务的土地利用政策。

致谢

该项目由地下网络保护协会资助。我们感谢肯尼亚林业局允许我们进入采样地点。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

测序数据可在国家生物技术信息中心获取：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，BioProject ID为PRJNA1186071。如有合理请求，相应作者将提供在本研究期间分析的任何其他数据集。