山竹（Garcinia mangostana）叶染料提取物：植物化学成分分析、光谱特性研究以及体外和计算机模拟评估

《Results in Chemistry》：Garcinia mangostana leaf dye extract: Phytochemical and spectroscopic characterization with in vitro and in silico evaluation

　　安茹·C|苏达·库马里·S
研究学者（注册号：22213152032004），S.T.印度教学院化学系，纳格尔科伊尔。隶属于马诺曼尼亚姆·桑达拉纳尔大学，阿比谢卡帕蒂，蒂鲁内尔韦利627012，泰米尔纳德邦，印度

**摘要**
天然植物提取物是生物活性化合物的重要来源，在现代药物发现中发挥着至关重要的作用。本研究首次系统地分析了山竹（Garcinia mangostana）叶染料提取物（呈黄褐色）中的生物活性成分。该提取物通过初步的植物化学筛选、GC–MS、HPLC、UV–Vis和FT-IR光谱技术进行了分析。初步的植物化学筛选发现其中含有多种生物活性成分，包括萜类化合物、单宁、皂苷、酚类化合物、苷类、生物碱、黄蛋白和黄酮类，表明其成分具有较高的化学多样性。GC–MS分析鉴定出六种主要化合物：2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮、2,4-二叔丁基酚、十六烷酸甲酯、苯丙酸3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基甲酯、苯丙酸3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基乙酯和硬脂酸甲酯。HPLC分析进一步确认了多种植物化学成分的存在，并检测到显著的酚类峰。药理学实验显示该提取物具有良好的抗炎活性、中等的抗氧化作用以及对MCF-7细胞的细胞毒性作用，IC50值分别为69.50 μg/mL、337.55 μg/mL和>100 μg/mL。抗菌分析显示其对白色念珠菌具有显著的剂量依赖性抗真菌活性，但对大肠杆菌的抗菌作用较弱。ADMET和毒性分析表明，除2,4-二叔丁基酚外，大多数化合物具有良好的药物相似性和安全性。分子对接分析支持了体外实验结果，显示其与与细胞毒性、抗炎和抗氧化作用相关的靶标具有较高的结合亲和力（?7.64至?8.51 kcal/mol）。这些发现表明山竹叶染料提取物可能成为未来药物发现和开发中生物活性化合物的来源。

**1. 引言**
山竹（Garcinia mangostana Linn.）是一种原产于东南亚的热带常绿树种，属于藤黄科。其果实因其独特的酸甜口感而被称为“水果之王”。山竹主要分布于马来西亚、印度尼西亚、泰国、缅甸、斯里兰卡和菲律宾等地。该属植物包括从常绿树到灌木的近400个物种[1][2]。已从山竹中分离并鉴定出多种生物活性化合物，如黄酮类、苯酚类、三萜类等[3]。此外，酚类、黄酮类、鞣花单宁、加尔辛酮、单宁、花青素、萜类、维生素B1、B2等也为其药用特性做出了贡献。其中，黄酮类被认为是山竹药理活性的主要次生代谢物[4]。

先前的研究表明，山竹中含有高水平的酚类化合物，尤其是α-山竹酮和γ-山竹酮，这些成分主要集中在果皮中。这些化合物具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗过敏和抗病毒作用[5][6]。因此，大多数研究集中在从果皮中提取和鉴定黄酮类化合物。最近的研究还发现茎、种子和心材中也含有生物活性成分[7][8][9]。在东南亚传统医学中，山竹被用于治疗皮肤感染、伤口愈合、腹泻和炎症等多种疾病[10]。山竹具有广泛的治疗作用，如保护心脏、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗过敏、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗抑郁、抗阿尔茨海默病和抗衰老等[11][12]。最新研究表明，富含黄酮类的山竹提取物可通过诱导细胞凋亡和调节细胞周期来抑制癌细胞增殖和转移。α-山竹酮是山竹各部分（包括叶子）中的主要黄酮类化合物，已被证明能抑制肿瘤生长、调节炎症途径并清除自由基。值得注意的是，富含色素的提取物中的花青素等有色植物成分在相关山竹物种中表现出良好的生物活性，表明它们可能对治疗效果有贡献。

尽管对山竹果皮、果实和果皮的传统溶剂提取物进行了广泛的药理学评估，但关于山竹植物其他部位（尤其是叶染料提取物）的治疗潜力的文献非常有限[13][14][15]。叶染料提取物具有特别的科学价值，因为它们富含天然色素化的植物化学物质，如花青素、酚类和黄酮类，这些成分可能比传统提取物具有独特的或增强的生物活性[15][16]。此外，染料提取方法符合可持续和环保的原则，与绿色化学和基于天然产物的药物发现技术的发展趋势一致。因此，研究山竹叶染料提取物是一种探索这一药用价值物种额外治疗潜力的新方法[17]。

尽管已有许多研究探讨了山竹的药理潜力，但大多数研究集中在其果皮或传统溶剂提取物上。尽管叶染料提取物富含天然色素化的植物化学物质（如花青素、酚类和黄酮类），这些成分可能具有独特的或增强的生物活性[15][16][17][18]，但相关研究仍较少。而且，染料提取方法环保且符合可持续发展的理念，支持绿色化学和基于天然产物的药物发现技术。本研究通过结合实验植物化学分析、药物相似性评估和分子对接研究，填补了这一研究空白，提供了其药用相关性的机制见解[19][20]。

本研究旨在通过评估山竹叶染料提取物的生物活性来探讨其药用潜力。通过对提取物进行植物化学、光谱学、GC–MS和HPLC分析，鉴定出主要的生物活性成分，并进一步评估其对MCF-7细胞的细胞毒性以及抗氧化和抗炎作用。同时，分析了这些化合物的药物相似性和毒性特征，并通过分子对接研究了它们与靶蛋白的相互作用，从而揭示了其生物活性的机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 样品采集
从印度泰米尔纳德邦卡纳库马里区的Thirpparappu采集了新鲜的山竹（Garcinia mangostana）叶子，用于制备染料提取物（图1）。该植物根据Bentham和Hooker系统进行了鉴定，鉴定证书见图S1（编号STHCX-0007），标本馆编号为STHCX-0007。购买票据和苗圃位置详情见支持信息文件（图S2和S3）。采集的叶子用自来水彻底冲洗以去除杂质，然后阴干并研磨成粉末，储存在密封容器中以备后续提取使用[20]。

2.2. 染料提取
使用索氏提取器从山竹叶子中提取染料。将10克山竹叶粉末放入漏斗中并安装在圆底烧瓶上，先用n-己烷脱脂6小时（温度68°C）。脱脂后的样品取出，晾干以去除残留的n-己烷，再用甲醇在65°C下进行提取。提取出的染料呈黄褐色，然后在40°C下烘干3小时并研磨成粉末（图S4）。总共使用10克样品进行甲醇提取，获得了6克染料粉末[21][22]。

2.3. 染料提取物的植物化学分析
在500毫升烧杯中，用100毫升甲醇提取5克山竹叶染料粉末。提取物通过Whatman 1号滤纸过滤后冷藏保存。使用该溶液检测山竹提取物中的植物化学成分（图2）。所有植物化学测试均按照文献中的标准程序进行[23][24]。

**2.4. 植物化学测试**
a. **单宁检测**
向5毫升染料提取物中加入10毫升溴水，观察到溴水褪色，证实其中含有单宁（单宁具有还原溴的能力）[24]。
b. **类固醇检测**
将少量染料提取物溶解在氯仿中，再加入乙酸酐，随后加入浓H2SO4。未观察到特征性颜色变化（从紫色变为蓝色或绿色），证实提取物中不含类固醇[24]。
c. **黄酮类检测**
进行碱性试剂测试以确认染料提取物中是否存在黄酮类。将2毫升2.0% NaOH溶液与染料提取物混合，出现黄色沉淀，加入两滴稀释酸后沉淀消失，证实含有黄酮类[23][24]。
d. **萜类检测**
向5毫升染料提取物中加入2毫升氯仿并在水浴中蒸发，残留物与3毫升浓H2SO4一起煮沸，出现红棕色沉淀，证实含有萜类[23][24]。
e. **皂苷检测**
将1毫升染料提取物与水剧烈振荡，出现持久泡沫层，证实含有皂苷[23][24]。
f. **酚类化合物检测**
将1毫升染料提取物溶解在酒精中，加入中性氯化铁，出现深蓝绿色沉淀，证实含有酚类化合物[24]。
g. **苷类检测**
将约5毫升染料提取物溶解在2毫升冰醋酸和1滴FeCl3中，再缓慢加入1毫升浓H2SO4，界面出现棕色环，证实含有苷类[23][24]。
h. **还原糖检测（莫利希试验）**
将染料提取物与α-萘酚处理，再缓慢加入几滴浓H2SO4，界面出现紫色环，证实含有还原糖[24]。
i. **生物碱检测**
将染料提取物用2N HCl酸化，过滤后加入迈尔试剂，形成白色浑浊沉淀，证实含有生物碱[23][24]。
j. **黄蛋白检测**
将染料提取物与浓HNO3处理，再加入过量氨水，形成红橙色沉淀，证实含有黄蛋白或芳香氨基酸[23][24]。

2.5. 特性分析
使用IR和UV–Vis光谱对新鲜制备的甲醇染料提取物进行光谱分析。FTIR光谱在4000–500 cm?1范围内扫描（使用Shimadzu FTIR 84005仪器）。UV–Vis光谱在200–800 nm范围内测量（使用Shimadzu UV-1800分光光度计），GC–MS分析使用Shimadzu GC-2014仪器进行。HPLC分析使用Shimadzu LC-20 CE系统在反相C18柱上进行，流动相为溶剂A（含1%甲酸的水）和溶剂B（乙腈）。样品注入量为20 μL，流速为1.0 mL/min，总运行时间为30分钟。

2.6. 生物应用
2.6.1. 抗炎活性
蛋白质变性试验通过检测染料提取物抑制蛋白质变性的能力来评估其抗炎潜力。反应混合物包含0.4毫升3%牛血清白蛋白和不同浓度的测试样品（6.25–100 μg），总体积为0.5毫升，37°C下孵育20分钟。然后向每个试管中加入2.5毫升磷酸盐缓冲液（pH 6.3），再加热至80°C孵育10分钟以诱导蛋白质变性，最后冷却至室温。不含测试提取物的PBS加BSA作为阴性对照，标准抗炎药物双氯芬酸作为阳性对照。实验重复进行了三次。吸光度使用分光光度计在660纳米处测量，蛋白质变性的抑制百分比按照以下方法计算[23]、[24]、[25]：抑制百分比 = (对照组吸光度 - 测试组吸光度) / (对照组平均吸光度) × 100。

2.5.2 抗微生物活性
使用琼脂孔扩散法评估了山竹叶染料提取物的抗微生物活性，针对不同的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。对于抗菌测试，使用了固化的Mueller-Hinton琼脂（25–20毫升）培养基。对于抗真菌测试，使用了Mueller-Hinton琼脂和Potato Dextrose琼脂（MH096 Himedia）的1:1混合物。准备了等距离分布的孔洞的固化培养基用于分析。DMSO作为染料提取物的溶剂，作为阴性对照；而庆大霉素（40微升，来自4微克/毫升的储备液）和克霉唑（40微升，来自300微克/毫升的储备液）作为阳性对照。对于测试样品，将10毫克染料提取物溶解在1毫升蒸馏水中，并在每个孔中测试了500微克和1000微克两种浓度。将50微升（500微克）和100微升（1000微克）的体积分别加入每个孔中。平板在37摄氏度下孵育24小时（针对细菌），在27摄氏度下孵育48小时（针对真菌）。实验重复进行了三次，并以毫米为单位记录了抑制圈的大小[26]、[27]。

2.5.3 抗氧化活性（DPPH测定）
对于DPPH测定，新鲜准备了60微摩尔的DPPH甲醇溶液，并将200微升该溶液与不同浓度的染料提取物（1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800微克/毫升）混合。平板在室温下避光放置15分钟，然后在515纳米处测量吸光度的下降。没有提取物的DPPH溶液作为阴性对照，而抗坏血酸（1毫克/毫升蒸馏水，w/v）作为阳性对照。实验重复进行了三次。使用以下公式计算自由基清除率[28]、[29]：抑制百分比 = (对照组吸光度 - 测试组吸光度) / (对照组吸光度) × 100。

2.5.4 细胞毒性分析（MTT测定）
MCF-7：人类乳腺癌细胞系（本研究使用的细胞系来自印度浦那的国家细胞科学中心（NCCS）；传代次数为36代）。将10,000个细胞接种到96孔板中，并让细胞适应培养条件，例如37摄氏度和5%二氧化碳的环境，孵育24小时。测试样品在DMEM培养基中制备，浓度为10毫克/毫升，并使用0.2微米Millipore注射器过滤器进行过滤灭菌。样品在DMEM培养基中稀释后加入含有培养细胞的孔中，最终浓度分别为6.25、12.5、25和100微克/毫升，未处理的孔作为对照。所有实验重复进行了三次，并取平均值以减少测试样品处理后的误差。平板进一步孵育24小时。孵育期结束后，吸出孔中的培养基并丢弃。然后在MTT溶液中向每个孔中加入100微升0.5毫克/毫升的PBS。平板进一步孵育2小时以形成甲酚蓝晶体。随后去除上清液，并向每个孔中加入100微升100%的DMSO。使用微孔板读数仪测量570纳米处的吸光度。仅用DMEM处理的细胞作为阴性对照，代表100%的存活率；多柔比星（一种标准的化疗药物）以1至10微克/毫升的浓度作为阳性对照，以验证测定的响应性并允许与测试染料提取物的细胞毒性潜力进行比较。每个板上有三个无细胞的孔作为空白对照，细胞存活率使用以下公式计算[30]、[31]：细胞存活百分比 = (处理组平均吸光度) / (对照组平均吸光度) × 100。

2.5.5 分子对接研究
进行了分子对接分析，以研究从山竹叶染料提取物中鉴定出的化合物与目标蛋白（PBD ID：3ERT、2ORP和8IVG）之间的结合亲和力。根据这些目标蛋白与细胞毒性、抗炎和抗氧化活性的生物学相关性选择了它们，这些活性与本研究中进行的药理学测定相对应。使用ChemDraw Professional 20.1软件绘制了配体的2D和3D结构，并进行了能量最小化处理。目标蛋白的3D结构从蛋白质数据库中获得，并使用PyMOL 2.6进行处理。对接模拟使用AutoDock Vina（版本1.2.0）进行，所得到的配体-蛋白相互作用使用Discovery Studio Visualizer 2021进行可视化和分析。通过重新对接天然配体确认了对接的可靠性，RMSD值≤2.5埃被认为是可接受的[32]、[33]。分子对接仅限于配体-蛋白相互作用的静态快照，没有考虑蛋白质的灵活性、溶剂化效应或动态细胞条件，这可能会限制体内结合预测的可靠性。

2.5.6 分子动力学（MD）模拟
使用YASARA Dynamics和AMBER力场进行了分子动力学（MD）模拟，以评估对接的蛋白-配体复合物的稳定性。首先对对接的化合物-蛋白复合物和参考配体-蛋白复合物进行了能量最小化处理，以消除不利的相互作用。MD模拟进行了100纳秒，然后定期记录轨迹数据以进行结构和相互作用分析。复合物的稳定性通过均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键相互作用进行分析。

2.6 统计分析
实验重复进行了三次（n = 3），数据表示为平均值±标准偏差（SD）。统计分析采用ANOVA，随后进行Tukey的事后检验以确定处理组之间的显著差异[34]。p值<0.05被认为具有统计学意义。

2.6.1 药物相似性和ADME/毒性预测
使用ADMETlab 2.0和SwissADME评估了选定化合物的药物相似性和药代动力学特性。根据Lipinski的五规则评估了化合物的合规性，以预测口服生物利用度、胃肠道（GI）吸收、血脑屏障（BBB）渗透性和细胞色素P450酶抑制，以估计药代动力学行为和潜在的药物-药物相互作用[35]。进行了毒性预测，包括致癌性、突变性和肝毒性，以识别存在安全问题的化合物[36]。

3. 结果与讨论
3.1 植物化学分析
制备的山竹叶染料提取物进行了初步的植物化学筛选（表1；图2）。如2.3节所述，提取物对几类植物化学物质呈阳性反应，突显了其丰富的植物化学成分。研究证实了其中含有萜类化合物、单宁、皂苷、酚类化合物、苷类、生物碱、黄蛋白和黄酮类。这些生物活性化合物因其多种药理特性而闻名：萜类化合物（抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌）、单宁（抗氧化、抗菌和抗炎活性）以及黄酮类（抗氧化、抗炎活性和抗癌）。山竹叶染料提取物中这些化合物的存在强烈表明了其治疗潜力[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。

表1. 山竹叶染料提取物的植物化学分析。
植物化学物质 | 分析结果 | 存在（+）/ 缺失（?）
-----------------|-----------------|----------------|
单宁 | + | ? |
类固醇 | ? | |
黄酮类 | + | |
萜类化合物 | + | |
皂苷 | + | |
酚类化合物 | + | |
糖苷 | + | |
生物碱 | + | |
黄蛋白 | + | |

3.2 气相色谱-质谱（GC–MS）分析
GC–MS分析检测到山竹叶染料提取物中含有六种结构多样的生物活性化合物，如图3所示。根据保留时间对检测到的峰进行分配，并通过与NIST质谱库的比较进行化合物鉴定，相关细节总结在表2中。鉴定出的化合物包括2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮、2,4-二叔丁基酚、十六酸甲酯、苯丙酸3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲酯、苯丙酸3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙酯和甲基硬脂酸酯。这些生物活性化合物可能对叶染料提取物的性质有所贡献[37]、[41]。其中，苯丙酸衍生物是主要成分（占43.24%），表明提取物中酚类成分占主导地位。酚类衍生物的检测与单宁和黄酮类的阳性植物化学测试结果一致。GC–MS鉴定出的脂肪酸酯代表了提取物的非极性成分。此外，提取物的棕色进一步支持了其中含有酚类和单宁成分。这些发现表明甲醇叶染料提取物含有多种生物活性次级代谢物[38]、[39]、[40]、[41]。

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图3. 山竹叶染料提取物的GC–MS色谱图。

表2. 通过气相色谱-质谱（GC–MS）在山竹叶染料提取物中检测到的生物活性化合物。
峰号 | 化学名称 | 保留时间 | 分子式 | 分子结构 | 峰面积百分比 |
-------|---------|--------|---------|-----------|
1 | 2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮 | C13H20O2 | 14.30 | 1 |
2 | 2,4-二叔丁基酚 | C14H22O4 | 16.68 | 0 |
3 | 十六酸甲酯 | C17H34O2 | 21.47 | 8 |
4 | 苯丙酸3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲酯 | C14H20O3 | 21.59 | 0 |
5 | 苯丙酸3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙酯 | C19H30O3 | 22.24 | 5 |
6 | 甲基硬脂酸酯 | C19H38O2 | 23.51 | 7 |
7 | | | | |

3.3 高效液相色谱分析
甲醇山竹叶染料提取物的HPLC色谱图（图4）显示了多个保留时间范围内的峰，表明存在多种植物化学成分。最初洗脱的峰在10分钟内的保留时间对应于极性化合物，如苷类和皂苷，在初步筛选中检测到。10至17分钟之间的峰归因于黄酮类和单宁。17至19分钟范围内的显著峰，其中18.11分钟处的主峰表明了酚类成分的优势；这一结果与GC–MS分析一致。19至35分钟之间的晚洗脱峰代表非极性化合物，包括脂肪酸酯。提取物的黄褐色进一步支持了其中含有酚类和单宁成分。这些发现表明甲醇叶染料提取物含有多种生物活性次级代谢物[38]、[39]、[40]、[41]。

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图4. 甲醇山竹叶染料提取物的HPLC色谱图。

3.4 结构-活性关系
在山竹叶染料提取物中检测到的生物活性化合物的药理活性可以与它们的结构特征相关联。化合物2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮具有刚性的三环骨架，带有酮基，这可能通过与细胞膜和生物分子的相互作用而发挥生物活性。这些特征与抗菌和抗炎特性相关[42]、[43]。酚类化合物，如苯丙酸衍生物和2,4-二叔丁基酚，含有酚-OH基团，已知其能够捐赠氢原子以稳定自由基。这些化合物中的四丁基取代基通过电子捐赠和空间效应稳定了酚氧自由基。这些特征与抗炎和抗氧化效果高度相关[44]、[45]、[46]、[47]、[48]。脂肪酸酯，如十六酸甲酯和甲基硬脂酸酯，具有长的亲脂链，可能有助于与细胞膜的相互作用。长的亲脂链也可能通过调节氧化过程来促进抗氧化和抗炎特性[45]、[46]、[47]、[48]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]。总体而言，这些结构特征——酚-OH基团、烷基/叔丁基团、酮基和脂肪链——直接支持了山竹染料提取物的抗氧化、抗炎和抗菌活性。

3.5 光谱学
3.5.1 UV–Vis和IR光谱
山竹染料提取物的UV–Vis光谱（图5a）在276纳米处显示出一个强烈的峰，这归因于共轭芳香环系统，特别是酚类或邻苯二甲酸酯结构。植物提取物中的多酚化合物通常在270–280纳米处显示一个带状光谱，这与早期关于富含多酚的植物提取物的报告一致，包括山竹提取物[54]。

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图5. (a) 山竹染料提取物的UV–Vis光谱 & (b) FTIR光谱
染料提取物的IR光谱（图5b）在3398厘米^-1处显示一个宽峰，这归因于酚类化合物（如黄酮类、单宁）的OH伸缩振动。在2949厘米^-1和2835厘米^-1处观察到的峰对应于烷基基团的CH伸缩振动，表明存在长链脂肪酸或其他亲脂化合物。1411厘米^-1处的峰进一步支持了这一结论，归因于CH弯曲振动。在1658厘米^-1和1020厘米^-1处观察到的峰分别对应于CO伸缩（酰胺或酯）和CO伸缩振动，表明染料提取物中存在酯类、蛋白质或苷类基团。680厘米^-1处的峰进一步支持了山竹染料提取物中存在黄酮类或其他芳香化合物，这些化合物在药物应用中起作用。类似的观察结果也已在山竹提取物中报告，将这些官能团与抗氧化、抗菌、细胞毒性和抗炎活性联系起来[53]、[54]、[55]。

3.6 生物应用
3.6.1 抗氧化活性（DPPH测定）
使用DPPH测定分析了制备的山竹染料提取物的抗氧化活性。将观察结果与标准抗坏血酸（IC50 = 28.19微克/毫升）进行了比较（图6a；表3；表S1）。结果以浓度（微克/毫升）与抑制百分比绘制。提取物在25微克/毫升时表现出26.32%的抑制作用，在200至400微克/毫升之间观察到50%的抑制作用（IC50为337.55微克/毫升）。在1000微克/毫升的浓度下，抑制作用达到63.88%。这些结果表明该染料提取物具有中等的抗氧化活性[56]。下载：下载高分辨率图像（126KB）下载：下载全尺寸图像图6. (a) GM染料提取物的抗氧化活性；(b) GM染料提取物的抗炎活性。表3. GM叶染料提取物的抗氧化活性、抗炎活性和细胞毒性数据。样品浓度（μg/mL）抗氧化活性 ± SD抗炎活性 ± SD细胞毒性 ± SD抑制百分比抑制百分比细胞存活率百分比00001.568.01 ± 0.229––3.1211.25 ± 0.343––6.2515.71 ± 0.3386.12 ± 0.1096.23 ± 0.9712.520.59 ± 0.25815.86 ± 0.3892.85 ± 0.442526.32 ± 0.49832.21 ± 0.0688.79 ± 0.325031.92 ± 0.39744.07 ± 0.1082.54 ± 1.8810038.67 ± 0.26161.05 ± 0.2075.79 ± 0.7820043.55 ± 0.399––40051.18 ± 1.087––80055.91 ± 0.576––100063.88 ± 0.575––使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行的统计分析显示，GM叶染料提取物的抗氧化活性在不同浓度之间存在显著差异（F = 605.29，p < 0.0001）。事后Tukey检验确认了清除自由基活性的剂量依赖性增加。较低浓度（1.56和12.5 μg/mL）与较高浓度（100–1000 μg/mL）之间存在显著差异。在较高浓度范围内（800–1000 μg/mL），差异缩小，表明存在饱和效应。这些结果证明了该提取物具有强烈的浓度依赖性抗氧化潜力[56]。根据文献调查，GM叶提取物含有高量的多酚，这与其强抗氧化活性相关。相比之下，叶染料提取物显示出中等活性。这些差异可归因于植物化学成分、溶剂极性和提取方法的不同[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]。如SAR活性分析所述，酚羟基的存在对清除自由基活性至关重要[56]。在本研究中，GC–MS检测到了2,4-二叔丁基酚、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯等酚类化合物，这些化合物可能有助于观察到的抗氧化活性。其他化合物如2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮和甲基硬脂酸也可能支持该提取物的抗氧化特性[57]、[58]。尽管其效力低于叶提取物和标准品，但这些结果表明GM染料提取物是抗氧化化合物的有希望的来源[59]、[60]。

3.6.2 抗炎活性
新制备的GM染料提取物的抗炎活性通过使用双氯芬酸作为标准药物（IC50 = 46.68 μg/mL）的蛋白质变性抑制试验进行了评估（图6b；表3）。该试验分析了6.25至100 μg/mL的浓度范围（表2；表S2）。在6.25 μg/mL时，抑制百分比较低。然而，在12.5 μg/mL时，抑制作用显著增加，从15.86%上升到100 μg/mL时的61.05%，IC50为69.50 μg/mL。单因素方差分析显示测试浓度之间存在高度显著的差异（F = 68,471.44，P < 0.0001），表明GM提取物的抗炎活性具有剂量依赖性。事后检验显示所有浓度（6.25–100 μmL）之间均存在显著差异（p < 0.05）。这一结果表明该提取物能够以剂量依赖的方式有效减轻炎症[60]、[61]。
GM染料提取物观察到的抗炎作用可能与其中含有的生物活性化合物有关，如2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮、十六烷酸甲酯、2,4-二叔丁基酚、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯和苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯，这些化合物与萜类、多酚和脂肪酸有关[61]。如SAR研究所述，酚羟基等官能团对于清除自由基活性至关重要[56]。在本研究中，GC–MS检测到了这些化合物。这些化合物可能有助于观察到的抗氧化活性。尽管其效力低于叶提取物和标准品，但这些结果表明GM染料提取物是抗氧化化合物的有希望的来源[59]、[60]。

3.6.3 细胞毒性分析（MTT试验）
使用MTT试验评估了GM染料提取物对MCF-7（人乳腺癌细胞系）的细胞毒性；筛选了6.25、12.5、25、50和100 μg/mL的浓度（图7a；表3和表S3）以评估其效果。在6.25和12.5 μg/mL时，细胞存活率分别为96.23%和92.85%。然而，随着浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，在25 μg/mL时为88.79%，在50 μg/mL时为82.54%，在100 μg/mL时为72.79%（图7b-7d）。IC50值大于100 μg/mL，表明需要更高的剂量才能产生显著的细胞毒性效应[62]。单因素方差分析显示不同浓度下的细胞存活率存在显著差异（p < 0.05）。事后分析确认细胞存活率以剂量依赖的方式下降，特别是在12.5 μg/mL及以上浓度时下降显著。这些结果表明GM染料提取物对MCF-7细胞表现出适度的、剂量依赖性的细胞毒性效应[60]、[61]。

3.6.4 抗微生物活性
使用琼脂孔扩散法评估了GM染料提取物对大肠杆菌（E. coli）和白色念珠菌（C. albicans）的抗菌活性，将50 μL（500 μg）和100 μL的提取物加入孔中（图8a和8b）。结果与阳性对照（庆大霉素/克霉唑）和阴性对照（DMSO）进行了比较（表4；表S4）。结果显示，GM染料提取物对白色念珠菌的抑制圈分别为9 ± 0.3 mm和11 ± 0.3 mm，对大肠杆菌的抑制圈分别为6 ± 0.3 mm和7 ± 0.4 mm。活性具有剂量依赖性，较高浓度下的活性更强。然而，与标准品（庆大霉素：20.0 ± 0.5 mm；克霉唑：22.0 ± 0.4 mm）相比，GM染料提取物的抗菌活性较低[63]。观察到的抗菌活性可能归因于其中含有的生物活性化合物，如酚类、脂肪酸酯和萜类衍生物，如2,4-二叔丁基酚、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯、十六烷酸甲酯和2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮。先前的研究表明这些化合物具有抗菌特性[63]、[64]。

3.7 药物类似性、ADME和毒性
进行了ADMET分析，以揭示检测到的生物活性化合物的各种药代动力学行为和安全特性（表S5）。在生物活性化合物中，2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮表现出良好的药代动力学特性和无毒特性，符合Lipinski五规则，具有较高的胃肠道吸收率、良好的血脑屏障穿透性（BBB）、中枢神经系统适用性，无CYP酶抑制作用，并且毒性较低，使其成为未来优化的有希望的骨架[65]。苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯也表现出良好的药代动力学特性和无毒特性。然而，其乙基类似物虽然具有高口服吸收率和良好的生物利用度，但可能因CYP相互作用而复杂化其代谢。相比之下，2,4-二叔丁基酚具有致癌性和皮肤刺激性警报，尽管其具有高口服吸收率和良好的生物利用度以及BBB渗透性，但它表现出高血浆蛋白结合率（98.4%）和多CYP抑制作用，进一步限制了其治疗应用[66]。十六烷酸甲酯具有较高的胃肠道吸收率和中枢神经系统适用性，但仅有一个Lipinski规则违反，由于溶解度低。重要的是，未观察到与CYP相关的问题，表明其代谢相对安全，尽管其溶解度低可能会限制其生物利用度，除非通过制剂方法进行优化[65]、[66]。相比之下，甲基硬脂酸表现出较差的渗透性和高脂溶性，以及CYP2C9抑制作用，这可能阻碍其治疗用途。然而，其安全边际表明可以通过制剂改进来克服这些限制[65]、[66]。总体而言，这两种化合物（1和4）具有药物样特性，适合进一步药理学研究，而其余化合物需要结构优化[65]、[66]。

3.8 分子对接分析
3.8.1 抗炎活性（PBD ID: 2ORP）
过氧化还原酶5（PRDX5）主要是一种抗氧化酶，调节细胞内ROS水平，与氧化应激介导的炎症反应密切相关。因此，进行了与PRDX5（PDB ID: 2ORP）的对接，以探索所选化合物（2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮、十六烷酸甲酯、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯、甲基硬脂酸）与可能参与观察到的抗炎活性的氧化应激相关靶标的潜在相互作用[67]、[68]（表5；表S6）。
表5. 通过GC–MS鉴定的生物活性化合物与抗癌、抗炎和抗氧化相关靶标的分子对接分析
化合物名称生物应用（PDB ID）结合相互作用结合能（kcal/mol）Doxorubicin（标准）抗癌（3ERT）1H键；1C-H键；4个烷基；1个Pi-烷基?11.241.422,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮抗癌（3ERT）7个烷基键?7.671.58 ?Diclofenac（标准）抗炎（2ORP）1-H键；1个Pi-硫；1个Pi-Pi堆叠?8.041.682,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮抗炎（2ORP）1-H键；1个Pi-Σ；1个烷基；1个Pi-烷基?7.861.21 ?十六烷酸甲酯抗炎（2ORP）1-H键；1-C-H键；4个烷基?7.981.11 ?苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯抗炎（2ORP）1-H键；1-C-H键；3个烷基?8.191.0 ?苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯抗炎（2ORP）2-H键；1-C-H键；1-Pi-供体H键；2个烷基；1-Pi-烷基?8.310.91 ?甲基硬脂酸抗炎（2ORP）3-烷基?8.510.85 ?Ascorbic acid（标准）抗氧化活性（8IVG）3-H键?7.881.212,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮抗氧化活性（8IVG）1-H键；2-Pi-烷基?7.971.23 ?2,4-二叔丁基酚抗氧化活性（8IVG）1-Pi-阳离子?7.981.09 ?苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯抗氧化活性（8IVG）1-H键；1-Pi-阳离子；1-烷基?8.070.97 ?甲基硬脂酸抗氧化活性（8IVG）1-C-H；3-烷基?8.420.81 ?2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮通过与目标的一个氢键（CYS-81）、一个pi-Σ（TRP-75）、一个pi-烷基（PHE-241）和一个烷基（PHE-241）相互作用，结合能为?7.86 kcal/mol（RMSD = 1.21 ?）（图9a）。十六烷酸甲酯形成两个氢键（ARG-80, PRO-79）和四个烷基（ARG-84, PRO-222, ALA-78, CYS-81），结合能为?7.98 kcal/mol（RMSD = 1.11 ?）（图9c）。
图9. (a) 2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮与2ORP的对接；(b) 苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯与2ORP的对接；(c) 十六烷酸甲酯与2ORP的对接；(d) 标准双氯芬酸与2ORP的对接。苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基甲基酯与两个氢键（GLY-83, GLN-144）和三个烷基（PRO-222, CYS-81, MET-246）相互作用，结合能为?8.19 kcal/mol（RMSD = 1.0 ?）。苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯与四个氢键（GLY-83, ILE-82, CYS-81, ARG-80）和两个烷基（VAL-224, ALA-78）以及一个pi-烷基（PHE-241）相互作用，结合能为?8.31 kcal/mol（RMSD = 0.91 ?）（图9b）。甲基硬脂酸与三个烷基（ILE-82, MET-246, VAL-224）相互作用，结合能为?8.51 kcal/mol（RMSD = 0.85 ?）。这些结果表明，所有五个分析的配体都显示出有利的结合能，范围从?7.64到?8.51 kcal/mol；这些有利的结合亲和力支持该提取物在抑制促炎介质中的作用。
与标准药物双氯芬酸相比，所有五个配体都表现出相当甚至更强的结合亲和力（PDB ID: 2ORP）。双氯芬酸的结合能为?8.04 kcal/mol，RMSD = 1.68 ?。结合模式由一个常规氢键（TYR-245）、一个π-硫（CYS-81）和一个π-π堆叠（TRP-75）稳定[69]。先前的研究表明，酚类化合物和脂肪酸衍生物可以通过调节ROS水平来调节氧化应激并发挥抗炎作用[70]、[71]、[72]、[73]。

3.8.2 抗氧化活性（PDB ID: 8IVG）
过氧化还原酶6（PRDX6）是一种重要的抗氧化酶，调节细胞内ROS并保护细胞免受氧化应激。在本研究中，使用DPPH自由基清除试验评估了抗氧化活性。为了提供观察到的抗氧化活性的机制见解，将所选化合物（2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮、2,4-二叔丁基酚、苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯和甲基硬脂酸）与PRDX6（PDB ID: 8IVG）进行了对接，以评估它们与这种抗氧化酶的潜在相互作用[72]、[73]、[74]（表5和S6）。
化合物2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮通过与目标的一个氢键（ARG-95）和两个pi-烷基（TYR-205, TYR-252）相互作用，结合能为?7.97 kcal/mol（图10b）。2,4-二叔丁基酚与一个pi-阳离子（ARG-95）相互作用，结合能为?7.98 kcal/mol（RMSD = 1.09 ?）。苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯与一个氢键（ARG-95）、两个pi-烷基（TYR-14, TYR-252）和一个烷基（ALA-236）以及一个pi-阳离子（ARG-95）相互作用，结合能为?8.07 kcal/mol（图10a）。
图10. (a) 苯丙酸-3,5-双(1,1-二甲乙基)-4-羟基乙基酯与8IVG的对接；(b) 2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮与8IVG的对接；(c) 标准抗坏血酸甲基硬脂酸与一个氢键（LEU-237）和三个烷基（ILE-239, ALA-236, ARG-95）相互作用，结合能为?8.42 kcal/mol（RMSD = 0.81 ?）。对接结果表明，所有四个配体都与PRDX6形成了多种相互作用，包括氢键、pi-烷基、烷基和π-π相互作用。甲基硬脂酸表现出最高的结合亲和力（?8.42 kcal/mol）（RMSD = 0.81 ?），而2,2,6,7-四甲基-10-氧杂环[4,3,0,1(1,7)十烷-5-酮在四个配体中显示出最低的结合能（?7.97 kcal/mol）（RMSD = 1.23 ?）。与标准抗氧化剂抗坏血酸（结合能为?7.88 kcal/mol，RMSD = 1.21 ?）相比，所有四个对接的配体都表现出相当或更强的结合亲和力，RMSD值范围为?7.97到?8.42 kcal/mol。值得注意的是，甲基硬脂酸表现出最强的相互作用（?8.42 kcal/mol），表明其结合稳定性高于抗坏血酸，而其他化合物的相互作用主要由氢键、疏水性和范德华力驱动。这些发现与先前的研究一致，表明酚类化合物和脂肪酸衍生物对参与氧化应激调节的蛋白质具有强亲和力[75]、[76]、[77]。

3.8.3 抗癌活性（PBD ID: 3ERT）
雌激素受体α（ER∝）在激素依赖性乳腺癌的进展中起着重要作用，通过调节雌激素介导的细胞增殖。由于MCF-7乳腺癌细胞表达雌激素受体，ER∝被认为是抗癌研究中的相关分子靶点[78]。选定的化合物2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮被对接到雌激素受体α（PDB ID：3ERT）中，以探索其与观察到的细胞毒性活性相关的潜在结合相互作用（图11；表5；表S6）。下载：下载高分辨率图像（533KB）下载：下载全尺寸图像

图11. (a) 2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮与3ERT的对接；(b) 标准多柔比星。

配体2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮表现出显著的结合能，为?7.67 kcal/mol（RMSD = 1.58 ?），并具有七个烷基相互作用（LEU-79、LEU-82、MET-83、MET-116、ALA-45、LEU-41、MET-38）。标准多柔比星表现出最高的结合亲和力，结合能为?11.24 kcal/mol，RMSD = 1.42 ?，表明其与目标蛋白（3ERT）之间有强且稳定的相互作用。配体相互作用包括一个常规氢键（ASP-46）、一个碳氢键（MET-83）、四个烷基键（LEU-82、ALA-45、LEU-41、PHE-99、LEU-86）和一个π-烷基键（LEU-231）。对接结果为观察到的对MCF-7细胞的中等体外细胞毒性提供了初步支持[79]、[80]。

3.9. 分子动力学模拟
对最佳化合物-蛋白质复合物[3ERT-2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮（?7.67 kcal/mol）、2ORP-甲基硬脂酸酯（?8.51 kcal/mol）和8IVG-甲基硬脂酸酯（?8.42 kcal/mol）进行了100 ns的分子动力学模拟，并将其与各自的参考化合物-蛋白质复合物[3ERT-多柔比星、2ORP-双氯芬酸和8IVG-抗坏血酸]在模拟期间进行了比较（图12a-c）。RMSD图显示所有复合物都很快达到平衡，并在整个刺激过程中保持稳定，仅有在可接受范围内的轻微波动。Rg图几乎保持不变（1.9–2.1 nm），表明蛋白质在整个模拟过程中保持了其结构紧凑性。SASA分析显示逐渐减小，表明结构更加紧凑，溶剂暴露减少。此外，氢键数量分析显示选定的化合物比标准化合物保持了更多的氢键，表明蛋白质-配体相互作用稳定。结果表明选定的化合物与目标蛋白质形成了稳定的复合物[81]、[82]。

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图12. 蛋白质-配体复合物的分子动力学模拟分析 (a) 2ORP-甲基硬脂酸酯和2ORP-双氯芬酸；(b) 8IVG-甲基硬脂酸酯和8IVG-抗坏血酸；(c) 3ERT-2,2,6,7-四甲基-10-氧杂三环[4,3,0,1(1,7)]癸-5-酮和3ERT-多柔比星。

4. 结论
在这项研究中，我们首次系统地研究了从印度泰米尔纳德邦Kanyakumari区Thirpparappu采集的Garcinia mangostana新鲜叶子中提取的叶染料。初步的植物化学分析确认了其中含有多种生物活性化合物，包括萜类化合物、单宁、皂苷、黄酮类化合物、生物碱和酚类化合物。GC–MS分析鉴定了提取物中的六种关键生物活性化合物，而HPLC分析进一步证实了初步的植物化学和GC–MS结果，表明存在多样的生物活性成分。该提取物表现出显著的抗炎和抗真菌活性，以及对MCF-7细胞的中等程度的细胞毒性和剂量依赖性细胞毒性。此外，分子对接研究显示这六种化合物对多个靶标具有强结合亲和力，表明它们的生物活性。分子动力学模拟进一步验证了对接结果，证明了稳定的蛋白质-配体相互作用。ADME/毒性预测表明，大多数化合物表现出更安全的特性，特别是苯丙酸3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基甲基酯，其药代动力学特性良好。相比之下，2,4-二叔丁基酚显示出致癌性和皮肤刺激警告，以及多种CYP酶抑制作用，表明可能存在毒性。这些发现提供了初步证据，表明GM叶染料提取物含有具有潜在药理活性的生物活性成分。然而，由于这项工作仅限于体外实验和计算预测，未来的药理学、毒理学和体内研究对于充分确定该提取物的治疗潜力是必要的。

关于AI工具使用的声明
作者声明ChatGPT（Open AI，GPT-5）仅用于本手稿的语言系统编辑和语法及清晰度的改进。

CRediT作者贡献声明
Anju C：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。
Sudha Kumari S：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。

资金
作者声明本研究未收到任何资助（不适用）。