微冷成型：一种简单、快速且成本低廉的微腔制造方法，适用于三维细胞培养

《RSC Advances》：Micro-cold-forming: a simple, rapid, and inexpensive method for the fabrication of microcavities for 3D cell culture

杰伊·拉宾德拉·库马尔·萨马尔（Jay Rabindra Kumar Samal）| 皮纳克·萨马尔（Pinak Samal）| 卡拉·普·卡塞拉斯（Carla Pou Casellas）| 马滕·B·鲁克马克（Maarten B. Rookmaaker）| 玛丽安·C·维尔哈尔（Marianne C. Verhaar）| 帕梅拉·哈比博维奇（Pamela Habibovi?）| 斯特凡·吉塞尔布雷希特（Stefan Giselbrecht）| 罗曼·库尔特·特鲁肯穆勒（Roman Kurt Truckenmüller）
梅尔恩技术驱动再生医学研究所（MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine），马斯特里赫特大学（Maastricht University）
荷兰马斯特里赫特，邮编6229
电子邮件：[e-mail] | [e-mail]

近期，微腔阵列被越来越多地用于控制培养三维细胞聚集体，如球状体、类器官（organoids）和原肠胚样结构（gastruloids）。然而，现有的制造技术仍然技术要求较高且难以普及。虽然微尺度热成型（micro(scale) thermoforming）已经用于从热塑性聚合物薄膜中制造薄壁微腔，但该过程需要专门的设备来精确控制成型温度和压力。本文介绍了一种新的微制造方法，我们称之为“微冷成型”（micro-cold-forming）。这种方法能够简单、快速且低成本地制造出直径为2毫米、深度在530至690微米之间的微腔，适用于厚度为25–30微米的热塑性聚合物薄膜。整个制造过程在室温下进行，并且仅使用市面上容易获得的、价格合理的组件。我们通过培养成人肾脏类器官（称为“管状体”）来证明这些微腔在3D细胞培养中的适用性。为了展示微腔在毒性研究中的应用潜力，将管状体暴露在高浓度的抗坏血酸环境中。这种新的成型技术可以为生物实验室和低收入国家的研究人员提供广泛且低成本的自行制造微腔的途径。

1. 引言
近年来，微腔在肠道类器官、支气管类器官和原肠胚样结构等细胞培养中得到了广泛应用。规则排列的微腔可以在定义的x、y、z方向上实现类器官的培养，从而实现高通量操作和成像，并且每个类器官都能被无障碍地观察——这是传统使用基底膜提取物（BME）的方法所无法实现的。使用微热成型技术，已经在薄热塑性聚合物薄膜中制造出了用于3D细胞培养的薄壁微腔。聚碳酸酯（PC）和聚苯乙烯（PS）这两种聚合物都可以通过微热成型加工；它们具有生物惰性，不会像聚二甲基硅氧烷（PDMS）那样吸收小分子，因此非常适合用于毒性和药物效果测试。然而，微热成型过程并不简单，因为需要精确控制温度和压力，这需要专门的设备。大多数聚合物的成型温度超过100°C，导致热成型模具及最终形成的薄膜冷却时间较长。如果使用水作为冷却剂，产生的蒸汽通常需要额外的排气步骤。此外，对于微压力（热）成型来说，较高的气体压力存在安全隐患，且需要能够安全处理这些压力的专用设备。这些挑战使得许多研究人员，特别是那些没有专用设备的生物实验室和低收入国家的研究人员难以使用这项技术。

本文描述了一种新的微制造方法——微冷成型，可以简单、快速且低成本地在热塑性聚合物薄膜中制造微腔。该过程在室温下进行，无需加热和冷却设备以及相应的时间消耗。此外，使用市面上容易获得的夹具和PDMS板施加压力，比使用气体压力更安全且无需特殊设备。该方法旨在在常用的培养基聚合物PC和PS薄膜中可重复地制造出微腔。为了证明这些微腔在3D细胞培养中的适用性，我们在悬浮培养条件下培养了成人肾脏类器官（管状体）。由于肾脏是药物诱导肾毒性的主要靶标之一，开发用于毒性筛选的体外细胞培养平台对于临床前安全性评估至关重要。我们通过将管状体暴露在高浓度的抗坏血酸中，验证了这些微腔在毒性研究中的有效性。结果表明，培养在微腔中的管状体保持了较高的存活率、顶端-基底极性以及与传统BME培养相当的肾脏特异性标记物表达。此外，与对照组相比，暴露于抗坏血酸的管状体表现出更明显的细胞死亡现象，证明了该平台适用于高含量毒性筛选。

2. 材料与方法
2.1 材料与试剂
PC薄膜（厚度10 μm和25 μm）购自it4ip；PS薄膜（厚度30 μm）购自Goodfellow；SILGARD 184弹性体套件（PDMS）购自Dow；BIOFLOAT FLEX购自faCellitate，用于防止细胞附着；管状体来自Hubrecht Organoid Technology（HUB）；Cultrex低生长因子基底膜提取物购自R&D Systems；Advanced DMEM/F-12培养基、GlutaMAX、B27补充剂、青霉素-链霉素、BlockAid封闭液、兔抗ZO-1抗体、Alexa Fluor 647 Phalloidin、Hoechst 33342、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 568标记的山羊抗鼠IgG均购自Thermo Fisher Scientific（Gibco）；Rspo1调节培养基购自U-Protein Express；EGF和FGF-10购自PeproTech；A83-01购自Tocris Bioscience；兔抗AQP-3抗体和鼠抗整合素α6抗体购自Abcam；鼠抗乙酰化微管蛋白抗体购自Santa Cruz；用于活细胞/死细胞染色的calcein AM和ethidium homodimer-1染料购自Invitrogen；甲醛和Triton X-100购自VWR；HEPES、N-乙酰半胱氨酸和抗坏血酸购自Sigma-Aldrich；RNeasy Micro Kit购自Qiagen；iScript cDNA合成试剂盒和iQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad。

2.2 微腔阵列的冷成型
使用Autodesk Inventor 2018设计了一个模具，该模具包含19个六边形排列的圆柱形孔，每个孔的直径为2毫米，深度为2毫米，孔间距最小为0.25毫米，并将其精密加工到4毫米厚的SAE 316不锈钢板上（图S1）。还制作了一个没有微腔的1毫米厚垫板。加工完成后，先用丙酮清洗模具板和垫板，再用乙醇清洗，最后干燥。对于PC微腔的冷成型，将以下材料堆叠在模具上：首先是一层标称厚度为25 μm的PC薄膜（待成型），然后是一层10 μm厚的PC薄膜（it4ip），接着是一层2.845 ± 0.062毫米厚的固化PDMS（Dow，SILGARD 184弹性体套件；固化剂与PDMS预聚物的比例为1:30，以下简称“1:30 PDMS”），最后是一层1毫米厚的SAE 316不锈钢板。添加额外的PC薄膜是为了防止PDMS板在成型后粘附在薄膜上。使用斯坦利Black & Decker公司的C型夹具（可施加680公斤的夹紧力）对堆叠材料进行夹紧，夹紧时间约为10秒后释放压力（图1）。对于PS微腔的制造，采用相同的过程和装置，但使用标称厚度为30 μm的PS薄膜（Goodfellow，产品编号82789543）代替25 μm厚的PC薄膜。选择PC和PS是因为它们是常用的生物惰性材料，适用于商业组织培养塑料器皿，不会吸收小分子，并且具有较高的光学透明度，便于后续成像。

2.3 PC和PS薄膜的厚度测量、扫描电子显微镜检查及微腔阵列的表面粗糙度和深度测量
使用长度测量仪（Heidenhain, MT 60M）测量PC和PS薄膜的厚度。使用扫描电子显微镜（Thermo Fisher Scientific/FEI, Teneo）对微腔阵列进行视觉检查，并在铝制支架上使用导电碳胶带固定后进行铱溅射涂层处理。表面粗糙度（面积粗糙度，Sa）和微腔深度使用基于3D共聚焦激光扫描显微镜的光学轮廓仪（Keyence, VK-X250）进行测量。

2.4 平面和成型PC及PS薄膜的荧光测量
使用荧光显微镜（Nikon, Eclipse Ti-S）测量平面和成型PC及PS薄膜的荧光特性。所有样品的测量条件相同，波长分别为390、488、568和647纳米。

2.5 用于细胞培养的微腔阵列准备
冷成型后，使用手动冲孔工具将微腔阵列冲出，并将其安装到带有聚合物盖片的24孔板中（ibidi, μ-Plate 24 Well, 产品编号82421），使用EPDM O型圈（ERIKS, 产品编号559273）密封。细胞培养前，将微腔阵列浸泡在70%乙醇中15分钟，然后用无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS；Sigma-Aldrich）冲洗两次。为防止细胞附着，按照制造商说明使用faCellitate公司的BIOFLOAT FLEX涂层处理阵列。

2.6 管状体培养
管状体（Hubrecht Organoid Technology, HUB代码HUB-05-A2-003）的培养方法如前所述。简而言之，将管状体片段接种在Cultrex低生长因子基底膜提取物（BME；R&D Systems）中，培养基为Advanced DMEM/F-12（Gibco），添加1%青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）、1% HEPES（Sigma-Aldrich）、1% GlutaMAX（Gibco）、1.5% B27补充剂（Gibco）、10% Rspo1调节培养基（U-Protein Express）、50 ng ml?1 EGF（PeproTech）、100 ng ml?1 FGF-10（PeproTech）和5 μM A83-01（Tocris Bioscience），培养条件为37°C和5% CO2。每2天更换一次培养基，每7天传代一次。对于在冷成型PC微腔中的悬浮培养，将管状体片段重新悬浮在含有10% v/v BME的Advanced DMEM/F-12培养基中并接种到微腔中。

2.7 活细胞/死细胞检测
根据制造商说明，使用calcein AM（Molecular Probes, Invitrogen）和ethidium homodimer-1（EthD-1；Molecular Probes, Invitrogen）分别对活细胞和死细胞进行染色。使用荧光显微镜（Nikon ECLIPSE Ti-S）观察微腔和BME培养中的管状体。通过ImageJ软件计算EthD-1阳性染色区域的百分比来评估细胞存活率。

2.8 免疫染色
使用STEMCELL Technologies公司的Cold Gentle Cell Dissociation Reagent提取BME培养中的管状体。在4°C下以100×g离心5分钟后，去除上清液，然后用4%甲醛（VWR）在PBS中固定管状体30分钟。对于PC微腔中的管状体，直接在芯片上用4%甲醛在PBS中固定30分钟。随后，在RT条件下使用BlockAid封闭液（Thermo Fisher Scientific）和0.5% Triton X-100渗透管状体，并用PBS冲洗两次。接着，在BlockAid封闭液中加入一抗，在4°C下孵育过夜，然后再次用PBS冲洗两次。之后加入一抗，包括兔抗AQP-3抗体（1:100；Abcam，产品编号ab125219）、鼠抗乙酰化微管蛋白抗体（1:2000；Santa Cruz，产品编号sc-23950）、兔抗ZO-1抗体（1:100；Thermo Fisher Scientific，产品编号40-2200）和鼠抗整合素α6抗体（1:200；Abcam，产品编号ab20142）。此外，还使用Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG（1:250；Thermo Fisher Scientific）和Alexa Fluor 568标记的山羊抗鼠IgG（1:250；Thermo Fisher Scientific）进行免疫染色。另外，还使用Alexa Fluor 647 Phalloidin（1:500；Thermo Fisher Scientific，产品编号A22287）和Hoechst 33342（1:1000；Thermo Fisher Scientific，产品编号H3570）对F-actin和细胞核进行染色。共聚焦荧光成像
荧光标记的聚集体使用旋转盘共聚焦荧光显微镜（尼康，ECLIPSE Ti-S）进行成像，配备60倍油浸物镜和20倍低工作距离物镜。使用高倍率物镜进行成像时，将管状结构置于35毫米的Petri皿中，底部装有玻璃盖片（ibidi，Glass Bottom Dish 35 mm，产品编号81218-200），并使用Dako荧光 mounting medium（安捷伦）。图像处理和分析使用NIS-Elements（尼康）或FIJI（https://fiji.sc/）软件完成，随后使用FIJI的QuickFigures插件将图像组合成图表。

2.12.10 定量聚合酶链反应分析
从冷成型PC微腔或BME圆顶中分离出管状结构，使用Cold Gentle Cell Dissociation Reagent（GCDR；STEMCELL Technologies）处理，然后在4°C下以300×g离心5分钟。根据制造商的说明，使用RNeasy Micro Kit（Qiagen）提取总RNA，随后使用iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）合成cDNA。基因表达的定量分析采用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在PCR机器（Bio-Rad，CFX96 Real-Time PCR Detection System）中进行定量（实时）聚合酶链反应（qPCR），具体步骤为：94°C变性5分钟，接着是60°C 15秒、60°C 20秒、72°C 40秒，最后在55–90°C范围内进行熔解曲线分析，每3秒升高0.5°C。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因进行基因表达标准化。数据使用2?ΔΔCt方法进行分析。用于基因表达分析的引物列在本手稿的补充信息（SI）中（表S1）。

2.11. 抗坏血酸处理
在冷成型PC微腔中培养管状结构3天后，向培养基中加入30 mM的抗坏血酸。将管状结构在37°C和5% CO2条件下在这种培养基中孵育24小时。通过活/死细胞染色评估管状结构的存活情况。在同一时间段内，使用不含抗坏血酸的培养基培养的管状结构作为对照。

2.12. 统计分析
在条形图中，条形代表平均值，误差条代表标准差（SD）。根据数据集的不同，使用Welch校正的单样本t检验或双因素方差分析（ANOVA）后进行Bonferroni事后多重比较检验，使用GraphPad Prism（GraphPad Software）软件。所有样本至少考虑了三次测量结果（N ≥ 3）。P < 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论
3.1. 微腔阵列的冷成型与表征
测量的PC和PS薄膜的厚度分别为25.8 ± 1.2 μm和32.3 ± 0.27 μm（图S2A和B）。从PC和PS制成的微腔表面光滑，扫描电子显微镜（SEM）观察不到明显的球形不规则性（图2A和B）。与未经处理的平面对照膜相比，微冷成型膜的表面粗糙度没有显著增加（图2C和D）。这一点很重要，因为微观地形或粗糙度会显著影响细胞粘附动力学，并降低成像时的光学透明度。使用光学轮廓仪测量PC和PS微腔的深度，分别为694.1 ± 13.5 μm和534.4 ± 84.5 μm（图2E和F）。即使手动拧紧C夹具，PC微腔的成型深度也具有很高的重复性。相比之下，PS微腔的深度较低且变异性较大，这可能归因于两种聚合物的机械性能差异。在室温下，PC表现出更明显的粘塑性变形和蠕变行为。此外，PS薄膜是双轴取向的。PS薄膜的厚度也大约厚25%。对于取向和/或较厚的薄膜，变形的PDMS板和拉伸薄膜之间的力达到平衡所需的成型深度比相同材料的非取向和/或较薄薄膜更浅。基于上述结果，第3.2节及后续章节中的所有实验均使用PC薄膜进行。

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图2. 冷成型微腔的表征。(A) PC微腔和(B) PS微腔的SEM图像（背面视图)。微冷成型和未经处理的平面(C) PC和(D) PS薄膜的表面粗糙度。所有值均相对于相应的平面对照膜进行了标准化。数据使用带有Welch校正的单样本t检验进行分析。N = 3。(E) PC和(F) PS微腔的深度使用光学轮廓仪测量。条形和误差条代表平均值±SD。(G) 微冷成型和未经处理的平面(H) PC和(H) PS薄膜的自荧光测量。条形和误差条代表平均值±SD。数据使用双因素方差分析后进行Bonferroni事后多重比较检验。N = 3。a.u.和ns分别表示任意单位和无显著性。

除了薄膜材料（PC与PS）外，我们还研究了PDMS板的厚度以及（待成型的）PC薄膜的厚度对成型过程和最终成型深度的影响。PDMS板的厚度超过之前提到的约2.8 mm时，微腔深度没有显著增加。对于较薄的PC薄膜（10 μm），虽然可以成功成型，但缺乏足够的刚性，导致在微冷成型后容易塌陷或起皱。相比之下，50 μm的较厚薄膜使得PC和PS的微腔深度显著减小。此外，尝试将微冷成型工艺应用于离子刻蚀的多孔PC薄膜时，会导致大量裂纹形成。这些孔隙可能成为裂纹的起始点。一个潜在的解决方案是先冷成型重离子辐照但尚未刻蚀的PC薄膜，然后在成型后仅刻蚀孔隙，正如我们之前与微热成型结合使用时所展示的那样。总之，聚合物类型和初始薄膜厚度影响冷成型微腔的最终结构完整性和深度。对于选定的设计参数，中间厚度（25–30 μm）获得了最佳结果，因为较薄的薄膜在冷成型后缺乏机械稳定性，而较厚的薄膜在室温下的可成型性有限。

由于荧光显微镜是细胞检测中广泛使用的技术，因此测量了PC和PS微腔在四种最常用波长（390、488、568和647 nm）下的自荧光。在任何波长下，与相应的对照膜相比，自荧光均未显著增加（图2G和H）。因此，微冷成型工艺预计不会干扰成像实验。

3D细胞培养用的微腔可以通过多种工艺制造，可以直接制造（例如，通过微钻孔或激光微加工），或者通过聚合物微模塑。后者包括在光刻模板上复制PDMS或琼脂糖水凝胶等材料，热压花和微热成型。与最相关的微热成型工艺相比，微冷成型既有优点也有缺点。冷成型在室温下进行，大大降低了设备成本。微热成型需要成本数千欧元的温度控制压力机，而微冷成型只需要不到10欧元的简单手动夹具。由于消除了加热和冷却时间（10分钟或更长），循环时间缩短到几秒钟。然而，目前描述的这种简单的微冷成型工艺限制了球形微腔的成型深度与特征宽度的比例约为0.3，而微热成型的比例高于1。

3.2. 冷成型微腔中的管状结构存活情况
为了证明所制备微腔适用于3D培养，我们在添加了10% BME的培养基中悬浮培养管状结构。使用calcein AM/EthD-1对在微腔和BME圆顶中培养4天的管状结构进行活/死细胞染色（图3A）。量化管状结构内的死亡面积百分比发现，圆顶中培养的管状结构的死亡面积较高（图3B）。圆顶中细胞死亡增加可能是由于氧气、营养物质和代谢废物的扩散受限。在传统的BME圆顶中，致密的水凝胶基质限制了物质传输。而在微腔中，管状结构处于悬浮状态，从而促进了与周围培养基的有效交换。

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图3. 微腔中的管状结构培养。(A) 在微腔和BME圆顶中培养4天的管状结构的活/死细胞染色。刻度条代表200 μm，适用于同一行的所有图像。(B) 比较管状结构总面积的死亡面积百分比。条形和误差条代表平均值±SD。数据使用带有Welch校正的单样本t检验进行分析。*p < 0.05。N = 3。(C–L) 在微腔和BME圆顶中培养4天的管状结构的免疫染色。刻度条代表(C, E, G, H, 和 J) 200 μm，(D, F, I, K, 和 L) 20 μm，适用于同一行的所有图像。AQP3、Tubulin、ZO-1和Integrin分别代表水通道蛋白-3、乙酰化微管蛋白、紧密连接蛋白-1和整合素α6。

3.3. 冷成型微腔中的顶基底极性和肾脏特异性标记物的表达
培养4天后，微腔中生长的管状结构与BME圆顶中生长的管状结构相似（图3A和C–L）。此时，对管状结构进行染色以评估顶基底极性和肾脏特异性标记物（图3C–L）。所有评估标记物的表达模式和定位在微腔和BME圆顶中培养的管状结构之间相似。这表明微冷成型微腔中的悬浮培养可以维持管状结构的表型。顶基底极性通过乙酰化微管蛋白（纤毛，顶端表面）、ZO-1（紧密连接，顶端外侧区域）和AQP3（基底外侧膜）进行评估。这两种条件下的顶基底极性建立是相当的。在肾脏中，这些蛋白质的正确极化对于肾功能至关重要，因为它能够促进水和溶质在管状上皮中的传输。在两种圆顶和微腔中培养的管状结构中都存在初级纤毛（乙酰化微管蛋白）以及ZO-1在顶端外侧连接处的定位，表明形成了分隔管腔内腔和间质区的功能性屏障。肾脏特异性标记物包括AQP3（集合管主细胞的基底外侧膜；也存在于其他上皮中但在肾脏中富集）和整合素α3（管状上皮细胞的基底膜）。这些身份标记物的表达在微腔培养的管状结构中得以保留，并且与BME圆顶中的对照管状结构相当。AQP3和乙酰化微管蛋白的共表达证实了存在纤毛集合管细胞（主细胞）。

为了评估不同肾脏区域标记物的表达，我们对在微腔和BME圆顶中培养4天的管状结构进行了qPCR（图4）。分析的基因及其相关的肾单位段和功能列在本手稿的补充信息（SI）中（表S2）。观察到特定运输标记物的表达存在显著差异。SLC4A4（近端肾小管）、NR3C2（盐皮质激素受体）和AQP3（集合管）在微腔中的管状结构中显著上调，表明微腔环境中的功能成熟度更高。这可能是由于微腔中的悬浮培养中物质传输更有效，从而减轻了代谢压力。这种代谢压力的减轻可能支持了耗能的转运蛋白合成过程，导致观察到的基因表达增加。此外，CLDN10基因在微腔中的管状结构中显著下调。先前的研究表明，紧密连接蛋白的表达受到周围环境机械力的影响。在悬浮培养中，管状结构受到的机械力可能比在BME圆顶中要小，这可能导致CLDN10的表达下调。未来的研究有必要阐明驱动悬浮培养和BME圆顶培养的类器官之间基因表达差异的机械转导途径。下载：下载高分辨率图像（682KB）下载：下载全尺寸图像图4. 培养第4天时，在圆顶和微腔中生长的管状结构的基因表达分析。条形图和误差条表示平均值±标准差。数据使用Welch校正的非配对t检验进行分析。*p < 0.05 和 ***p < 0.001。N = 3。

4. 抗坏血酸毒性研究
为了证明该平台在毒性研究中的适用性，将管状结构在冷成型微腔中培养24小时后暴露于30 mM的抗坏血酸中，然后进行活/死细胞染色以评估其存活能力。虽然抗坏血酸在生理浓度下具有抗氧化作用，但较高浓度（mM范围）可能会产生严重的细胞毒性。此外，过量摄入抗坏血酸与患者中的草酸肾病和急性肾损伤（AKI）有关。活/死细胞染色显示，与对照组管状结构相比，暴露于抗坏血酸的管状结构中出现了明显的细胞死亡。这一（显著的）效应通过量化管状结构中死亡区域的百分比得到了证实（图5）。这表明微冷成型腔体可以成为药物和毒性筛选的可行工具。下载：下载高分辨率图像（736KB）下载：下载全尺寸图像图5. 抗坏血酸毒性研究。(A) 暴露于30 mM抗坏血酸的管状结构与对照管状结构的活/死细胞染色。比例尺表示200 μm，适用于所有图像。(B) 比较死亡区域百分比与总管状结构面积。条形图和误差条表示平均值±标准差。数据使用Welch校正的非配对t检验进行分析。***p < 0.001。N = 3。

4. 结论与展望
我们开发了一种简单、快速且成本低廉的微冷成型技术，可以在热塑性聚合物薄膜中制造微腔体，无需特殊设备甚至洁净室。然后，我们通过优化管状结构的悬浮培养来证明所制造微腔体在3D细胞培养中的适用性。我们将这些管状结构的存活能力、极化特性和肾脏标志物表达与在BME圆顶中培养的管状结构进行了比较。接下来，我们进行了抗坏血酸的毒性研究，以证明微腔体在毒性筛选中的适用性。由于其简单且成本效益高的特点，微冷成型技术既适用于生物实验室，也适用于低收入国家。

由于本研究的主要目标是开发一个易于使用、低门槛的3D细胞培养平台，我们的系统研究集中在直接与该生物应用相关的工艺参数上，包括薄膜材料（PC和PS）、薄膜厚度以及PDMS性能的变化。对于模具，我们特别使用了一种简单的毫米级圆形设计。选择这种几何形状是因为圆形特征可以容易地制造（例如，通过钻孔），符合我们开发适用于低收入环境的过程的意图。此外，由此产生的U形腔底非常适合细胞培养，因为它促进了细胞向最深处沉淀，从而有利于3D聚集体的形成。毫米级的腔体也非常通用，能够容纳从小球体到毫米级类器官的各种尺寸。然而，对于需要其他基础几何形状（例如，延长结构）或更清晰轮廓而非平滑圆底的应用，未来的研究将需要系统地定义微冷成型过程的几何限制和复制精度。

未来的研究应探讨用于3D细胞培养的替代热塑性薄膜。候选材料应同时具备冷成型能力、可作为薄膜使用（其中一些已经是双轴取向的）、生物相容性或细胞相容性、高透明度，并且能够抵抗细胞培养工作中常用的化学物质，包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）、环状烯烃聚合物（COP）和环状烯烃共聚物（COC）。

作者贡献
J. R. K. S.：概念化、数据管理、正式分析、研究方法、验证、可视化、初稿撰写、审阅与编辑。
P. S.：概念化、正式分析、研究方法、验证、可视化、撰写、审阅与编辑。
C. P. C.：研究方法、撰写、审阅与编辑。
M. B. R.：撰写、审阅与编辑。
M. C. V.：资金获取、研究方法、撰写、审阅与编辑。
P. H.：资金获取、撰写、审阅与编辑。
S. G.：概念化、资金获取、研究方法、撰写、审阅与编辑。
R. K. T.：概念化、正式分析、资金获取、研究方法、监督、验证、撰写、审阅与编辑。

利益冲突
作者声明以下利益冲突：S.G. 和 R.K.T. 是300MICRONS GmbH公司的创始人、股东和董事，该公司从事3D细胞培养平台领域的工作。

数据可用性
本研究的数据可在已发表的文章及其电子补充信息（SI）中找到。补充信息包括额外的图表（图S1、S2，表S1和S2），展示了模具的照片和高度图、薄膜厚度的测量结果以及分析的基因列表及其相关的肾单位段和功能概述。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra02741e。