通过基于透明质酸的纳米平台将吉西他滨精准递送到肺癌细胞中

《RSC Advances》：Targeted delivery of gemcitabine to lung cancer cells via a hyaluronic acid-based nanoplatform

冯波宇|曹静丹|范行军|高俊霞|刘桂芳|林崇环|朱颖|王强
中国黑龙江省牡丹江市牡丹江医学院北方医药资源开发与应用协同创新中心

为了减轻吉西他滨（GEM）在肺癌治疗中的剂量限制毒性，我们开发了一种基于透明质酸（HA）的靶向纳米平台，该平台具有持续释放药物的能力——GEM@HA-(HAP/PSI)。该系统由羟基磷灰石/聚琥珀酰亚胺（HAP/PSI）复合核心组成，用于高效装载药物，表面共轭的HA作为CD44靶向配体。通过响应面方法进行系统优化后，所得到的球形纳米颗粒（约100–200纳米）表现出pH响应性药物释放、良好的生物相容性和可忽略的血细胞溶解活性。使用CD44高表达的A549细胞和CD44低表达的H358细胞进行的体外研究表明，CD44介导的主动内吞作用是该纳米平台的主要摄取途径。与非靶向对照配方相比，使用优化配方（GEM@HA-(HAP/PSI)10）处理后，显示出显著的细胞毒性增强、细胞迁移和克隆形成抑制以及凋亡诱导。重要的是，在A549异种移植小鼠模型中，GEM@HA-(HAP/PSI)10在抑制肿瘤生长方面优于游离GEM，同时保持了良好的安全性。总体而言，这些发现表明，本研究中开发的HA靶向纳米平台提高了GEM递送的精确性和治疗效果，并有望降低其全身毒性。

1. 引言
肺癌仍然是一个严重的全球公共卫生挑战。根据国际癌症研究机构（IARC）发布的2022年全球癌症统计（GLOBOCAN），癌症导致全球约967万人死亡，相当于约2.5亿年的伤残调整生命年。值得注意的是，中国承受着这一疾病的最大负担，肺癌在所有癌症类型中发病率（106万新病例）和死亡率（733,300例）均最高。目前的肺癌临床管理策略包括手术切除、靶向治疗、免疫治疗、化疗和放疗。对于早期患者，手术可提供40–80%的5年生存率。然而，由于肺癌的隐匿性发病，大约70%的患者在局部晚期或转移阶段被诊断出来，此时根治性手术往往不再可行。在晚期疾病中，全身药物治疗仍然是主要的治疗策略。尽管靶向药物最初对符合条件的患者有效，但几乎不可避免地会出现治疗耐药性。因此，化疗仍然是大多数晚期肺癌患者控制肿瘤进展和延长生存期的基石。传统化疗的一个主要局限性是缺乏选择性，这通常会导致健康组织的严重损伤、剂量限制毒性以及药物耐药性的产生，从而导致频繁的治疗中断。因此，迫切需要开发高效、特异性强、安全且可临床转化的药物递送系统。这样的平台可以实现化疗药物的精确细胞内递送，从而最小化脱靶效应，降低所需剂量，提高治疗效果，并可能加速抗癌药物的开发。

纳米技术为解决这些挑战提供了有希望的解决方案。基于纳米载体的药物递送系统（NDDSs）在生物医学领域引起了广泛关注，因为它们能够实现靶向递送和可控的药物释放。纳米材料的高表面积与体积比使其能够与靶向配体结合，从而提高肿瘤选择性。通过包封、吸附和治疗剂的共轭，NDDSs可以提高难溶性药物的生物利用度，并通过增强渗透性和滞留效应（EPR）促进其在肿瘤组织中的优先积累，最终改善治疗效果同时降低全身毒性。此外，NDDSs可以通过绕过外排泵、靶向癌干细胞（CSCs）和调节肿瘤微环境来帮助克服多药耐药性（MDR）——这是化疗失败的主要原因之一。由于这些进展，NDDSs正在成为临床肿瘤学的变革性工具，推动靶向治疗、联合治疗策略和早期癌症诊断的发展。

NDDSs的靶向策略大致可以分为被动靶向、主动靶向或刺激响应型。被动靶向利用EPR效应，使纳米载体优先通过肿瘤组织的渗漏血管并因淋巴引流不足而滞留。然而，EPR效应存在显著的肿瘤内和肿瘤间异质性，肿瘤内的高间质液压力会阻碍纳米载体的深入渗透。为了克服这些限制，开发了主动靶向策略。这些策略涉及将纳米载体与靶向配体（如抗体、肽或多糖）结合，这些配体选择性地结合到癌细胞上过度表达的受体上。随后，配体-受体相互作用促进受体介导的内吞作用和细胞内药物释放，从而提高肿瘤特异性和细胞内积累，同时最小化健康组织的摄取。在潜在靶点中，CD44受体（一种跨膜糖蛋白）已成为主动递送的有希望的靶点。CD44在多种癌症中过度表达，包括大多数肺癌，并在肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药性中起关键作用。相比之下，在正常组织中，CD44的表达水平较低或功能不活跃。透明质酸（HA）是细胞外基质的主要成分，是CD44的天然配体，CD44–HA相互作用在肿瘤进展和转移中起着关键作用。因此，HA修饰的纳米载体可以选择性地结合到CD44过度表达的癌细胞上，促进肿瘤特异性药物递送，增强细胞内摄取，并减少脱靶毒性。此外，HA具有生物相容性、可生物降解性和非免疫原性，已广泛应用于临床和实验应用，包括药物递送和生物医学成像。因此，通过HA靶向CD44不仅在药物递送方面具有巨大潜力，而且在肿瘤成像和治疗诊断方面也有应用前景。

在这项研究中，我们使用羟基磷灰石（HAP）和聚琥珀酰亚胺（PSI）作为核心材料，开发了一种基于HA的靶向NDDS。HAP是骨骼的主要无机成分，具有优异的生物相容性、生物活性和高药物装载能力。同时，PSI是一种无定形的、可生物降解且无毒的聚合物，通过无溶剂聚缩合天冬氨酸合成，符合绿色化学原则。重要的是，PSI可以通过胺诱导的环 opening 反应轻松进行功能化，从而引入靶向基团同时保持可生物降解性。与传统的纳米载体（如脂质体或聚合物胶束）相比，后者通常具有低药物装载能力、复杂的合成过程、较差的胶体稳定性和放大瓶颈，HAP/PSI混合系统独特地结合了高药物装载能力、良好的生物相容性和便捷的表面功能化。然而，现有的基于HAP/PSI的系统缺乏主动肿瘤靶向性，目前还没有研究利用透明质酸（HA）功能化在这些混合纳米颗粒上实现肺癌治疗的靶向递送。为了解决这一空白，我们的团队之前已经证明PSI及其衍生物（X-PSI）可以与HAP共组装形成具有高效药物装载能力的均匀纳米颗粒（HAP/PSI或X-(HAP/PSI）。在此基础上，本研究的核心思想是将HA（一种在肺癌细胞上过度表达的CD44天然配体）与PSI结合，生成靶向聚合物（HA–PSI），然后与HAP共组装生成核心-壳纳米颗粒，称为HA-(HAP/PSI）。这种纳米平台装载了吉西他滨（GEM），这是一种一线肺癌化疗药物。GEM是一种核苷类似物，细胞内激活后抑制DNA合成并诱导凋亡。然而，其临床应用受到剂量限制的不良反应的限制，包括骨髓抑制和胃肠道毒性。我们假设GEM@HA-(HAP/PSI)系统将通过CD44介导的内吞作用增强GEM的肿瘤特异性递送，实现可控的细胞内药物释放，减少在健康组织中的非特异性分布，最终提高GEM在肺癌治疗中的治疗指数。

2. 材料与方法
2.1. 材料
所有化学品和试剂均为分析级或更高级别，按接收状态使用。Tween-80购自BioFroxx有限公司。丁酸丁酯、氯化钙、磷酸、碳酸钠、磷酸二氢钠、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷和乙腈分别购自天津恒星化学试剂制造有限公司、哈尔滨试剂化工厂、天津天利化学试剂有限公司、天津博迪化学有限公司、天津富宇精细化工有限公司和天津永大化学试剂有限公司。L-天冬氨酸由Aladdin有限公司提供。盐酸吉西他滨、溴化钾、1,6-己二胺和香豆素6购自上海Macklin生化技术有限公司。透明质酸（HA，分子量约3000 Da）购自上海Eon化学技术有限公司。MES缓冲液、EDCI和NHS购自上海豫源生物技术有限公司。

用于细胞培养和体外研究，胎牛血清（FBS）购自Sino Biological Inc.；胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素-链霉素（100×）、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、DAPI染色液、4%甲醛固定剂和抗褪色 mounting medium 购自Seven Innovation（北京）生物技术有限公司；RPMI 1640培养基购自Thermo Fisher Scientific Inc.；结晶紫染色剂、Hoechst 33342和DAPI购自Beyotime生物技术有限公司；Calcein-AM/PI双染色试剂盒购自Solarbio Science & Technology Co., Ltd. 内吞抑制剂氯丙嗪、吲哚美辛和秋水仙碱购自MedChemExpress。

用于体内和组织学研究，2%红细胞悬浮液由广州鸿泉生物技术有限公司提供；临床级盐酸吉西他滨注射液（批号：246962DP）购自Eli Lilly and Company；苏木精和伊红（H&E）染色试剂购自上海Titan Technology Co., Ltd.；无水乙醇、二甲苯、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和氯化钾由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.提供；TUNEL凋亡测定试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.

2.2. 动物和伦理声明
雄性BALB/c裸鼠（8周龄，20–25克）由Sibeifu（北京）生物技术有限公司提供，并在特定无病原体（SPF）条件下饲养。动物房温度保持在23 ± 3 °C，相对湿度为30–70%，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取标准啮齿动物饲料和水。所有动物实验均按照牡丹江医学院的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得牡丹江医学院动物伦理委员会的批准（批准号IACUC-20251015-303）。

2.3. 方法
2.3.1. 辅料的合成
2.3.1.1. HAP和PSI的制备
HAP和PSI的合成方法参考了我们之前的研究。

2.3.1.2. HA–PSI结合物的制备
2.3.1.2.1. HA–NH2的制备
将HA粉末（0.5克，约0.17毫摩尔，分子量约3000 Da）溶解在20毫升MES缓冲液中，室温（约25 °C）下搅拌。然后依次加入EDCI（0.095克，0.495毫摩尔）和NHS（0.057克，0.495毫摩尔）。激活2小时后，加入1,6-己二胺（0.038克，0.33毫摩尔）。反应混合物在室温下连续搅拌24小时。然后将产物转移到透析袋（分子量：1000 Da）中，用去离子水透析24小时以去除过量试剂和缓冲盐。纯化的溶液通过冻干（FDS-1000，Tokyo Rikakikai Co., Ltd）获得胺功能化的HA（HA–NH2）。

2.3.1.2.2. HA–NH2与PSI的结合
PSI（基于重复单元–C4H3NO2? 的分子量计算为97.07）溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，浓度为6毫克/毫升。为了实现不同的HA与PSI的摩尔比，使用不同量的PSI：0.03克（0.31毫摩尔）用于1:10比例（记为HA–PSI10），0.06克（0.62毫摩尔）用于1:20比例（HA–PSI20），0.12克（1.24毫摩尔）用于1:40比例（HA–PSI40）。HA–NH2（0.10克，约0.03毫摩尔）分别溶解在相应的PSI/DMF溶液中。混合物在65 °C下搅拌18小时。随后，每种反应混合物用去离子水透析（分子量：1000 Da）48小时以去除DMF。最终的水溶液通过冻干获得HA–PSI结合物固体产物。其中，HA–PSI10显示出最高的HA掺入量，而HA–PSI40的掺入量最低。

2.3.1.3. 特性分析
合成材料的化学结构通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱法进行表征，使用Nicolet iS5光谱仪（Thermo Fisher, USA）。光谱记录范围为400–4000 cm?1，分辨率为1 cm?1。质子核磁共振（1H NMR）光谱在Avance NEO 400 MHz光谱仪（Bruker）上进行，使用二甲基亚砜-d6（DMSO-d6）作为溶剂。形态学检查使用扫描电子显微镜（SEM，S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation）进行。热稳定性通过热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）在STA 449 F5 Jupiter仪器（NETZSCH）上进行，氮气气氛下（流速为10毫升/分钟），温度从30 °C升至800 °C，升温速率为10 °C/分钟。晶体结构通过X射线衍射（XRD）分析在XRD-7000衍射仪（岛津，日本）上进行评估，使用Cu Kα辐射（λ = 1.5418 ?），并扫描2θ范围从10°到70°，速率为5°·min?1。2.3.2 GEM负载的纳米药物递送系统的配方和优化2.3.2.1 确定HA-(HAP/PSI)纳米球自组装的最佳比例基于初步数据，使用不同的涂层材料（HA–PSI40、HA–PSI20或HA–PSI10）与核心材料（HAP）的质量比（6:1、8:1和10:1）制备HA-(HAP/PSI)纳米制剂，以确定纳米球制备的最佳比例。首先将壳形成材料（HA–PSI）在DMF中以25 mg mL?1的浓度溶解，并在超声波（40 kHz）下处理以获得澄清溶液。另外，将HAP悬浮液制备在蒸馏水中。然后在室温下，在连续磁力搅拌（1000 rpm）下将HA–PSI/DMF溶液逐滴加入HAP悬浮液中。加入完成后，将混合物以12,000 rpm离心。收集的颗粒用蒸馏水反复洗涤，随后冻干8小时。通过SEM表征所得纳米颗粒的形态，以确定每种HA–PSI类型的适当质量比。2.3.2.2 单因素实验2.3.2.2.1 药物浓度对包封效率（EE）和药物装载能力（DLC）的影响HAP的浓度固定在5 mg mL?1。同时，将GEM溶解在蒸馏水中，制备浓度为5、10、20、30、40和50 mg mL?1的溶液。然后，向每种药物溶液中加入25 mg的HAP。混合物通过超声波（40 kHz，2分钟）均质化，然后静置10分钟。将分散液进行高速离心（12,000 rpm）。收集上清液，并用少量蒸馏水多次洗涤沉淀物。将洗涤液与上清液合并并稀释至固定体积。通过使用UV-2700i分光光度计（岛津）在350 nm处测量吸光度，并根据标准校准曲线确定该溶液中未包封的GEM的浓度（图S1）。每种条件重复三次测试。EE和DLC使用以下公式计算：EE (%) = (M1/M0) × 100DLC (%) = M1/(M1 + M2) × 100其中，M1是载体内装载的GEM的质量，M0是添加的GEM的总质量，M2是空白载体的质量。2.3.2.2.2 HAP浓度对EE和DLC的影响GEM的浓度固定在40 mg mL?1。然后，将HAP浓度变化为1、2、3、5、8、10和15 mg mL?1。按照上述方法处理混合物，并确定HAP浓度范围以优化EE和DLC。2.3.2.2.3 吸附时间对EE和DLC的影响在容量瓶中制备GEM溶液（40 mg mL?1）。然后，向该溶液中加入HAP以达到5 mg mL?1的浓度，随后通过超声波（40 kHz，2分钟）均质化。允许吸附进行10、20、40和60分钟。在每个时间点，离心混合物，并按照上述方法处理上清液以定量GEM。计算EE和DLC，并对每个时间点的样品进行三次测试。2.3.2.3 GEM@(HAP/PSI)和GEM@HA-(HAP/PSI)的配方和工艺优化基于单因素实验的结果，采用Box–Behnken设计（BBD）响应面方法优化GEM@(HAP/PSI)配方。关键因素如下：药物浓度（30–50 mg mL?1）、HAP浓度（3–8 mg mL?1）以及PSI与HAP的质量比（3:1至8:1）。根据实验数据生成响应面图，以指导最终配方的选择。对于目标配方GEM@HA-(HAP/PSI)10、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)40，使用Design Expert软件（版本10.0.1）实施中心复合设计（CCD）。影响因素是GEM浓度（30–50 mg mL?1）和HAP浓度（3–8 mg mL?1），而固体涂层材料HA–PSI的量（如2.2.2.1节所述）保持不变。最终优化的配方通过SEM、粒径分布分析和使用Malvern Nano ZS仪器（Spectris China Ltd，上海）测量zeta电位进行表征。2.3.3 纳米颗粒性质的评估2.3.3.1 体外药物释放研究在模拟生理条件下研究了配方的体外药物释放曲线。简而言之，将10 mg的GEM负载纳米制剂放入含有不同pH值（5.0、6.8和7.4；10 mL）的缓冲溶液的离心管中。试管在恒温摇床中以37 ± 0.5 °C和100 rpm的搅拌速度下孵育。在预定的时间间隔（1、2、4、6、12、24和72小时）取出样品并离心。收集上清液，并洗涤沉淀物。将洗涤液与上清液合并，并在350 nm处测量所得溶液的吸光度。根据标准校准曲线确定释放的GEM浓度，并确定药物释放曲线。2.3.3.2 溶血试验制备2%的红细胞悬浮液。随后，设置22个离心管（每个管5 mL），每个管加入2 mL的红细胞悬浮液。阳性对照管含有2 mL的蒸馏水，阴性对照管含有2 mL的生理盐水（0.9% NaCl）。其余管分为四个实验组（每组五个管，对应不同的纳米制剂）。然后，向每个实验管中加入0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 mL的5% GEM纳米制剂悬浮液。轻轻混合样品并在37 °C的恒温水浴中孵育3小时。孵育后，离心试管。使用SpectraMax M3微孔板读数仪在545 nm处测量所得上清液的吸光度。按照以下公式计算溶血率：溶血率 (%) = (A ? A0)/(A1 ? A0) × 100%，其中A、A0和A1分别代表测试样品、阴性对照样品和阳性对照样品的吸光度水平。2.3.3.3.3 体外细胞相容性和靶向性2.3.3.3.1 细胞培养选择A549细胞（高CD44表达）和NCI-H358细胞（低CD44表达）进行实验。通过混合RPMI-1640培养基、热灭活的胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（100:10:1比例）制备两种细胞系的完整生长培养基。细胞在37 °C的加湿培养箱中在5% CO2下培养。2.3.3.3.2 空白载体细胞毒性试验将对数生长期的细胞以每孔1 × 104细胞的密度接种到96孔板中。孵育24小时后，用含有空白载体（(HAP/PSI)、HA-(HAP/PSI)40、HA-(HAP/PSI)20或HA-(HAP/PSI)10的新鲜培养基（浓度范围为2.5至25 μg mL?1）替换培养基。孵育24小时后，根据制造商的说明使用CCK-8测定细胞活力。在450 nm处测量吸光度（OD450）。2.3.3.3.3 使用CCK-8测定细胞增殖将细胞用游离GEM或GEM负载的制剂（GEM@(HAP/PSI）、GEM@HA-(HAP/PSI)40/20/10）以等效药物浓度（2.5–25 μg mL?1）处理24小时。随后，使用上述方法测定细胞活力。2.3.3.3.4 细胞摄取研究使用香豆素6（C6）作为荧光探针。在组装过程之前，将C6掺入PSI或HA–PSI溶液中制备C6标记的纳米颗粒。同时，将A549和H358细胞接种到24孔板的玻璃盖玻片上。附着后，用荧光标记的制剂处理细胞0.5、2和4小时。然后用4%甲醛固定细胞，并用DAPI染色，使用荧光显微镜成像。2.3.3.3.5 细胞摄取机制研究将A549细胞接种到24孔板的盖玻片上（每孔1 × 105细胞）并培养24小时。细胞粘附后，用含有不同内吞抑制剂（氯丙嗪（CPZ，10 μg mL?1）、秋水仙碱（8 μg mL?1）或吲哚美辛（100 μM）的培养基替换原始培养基。细胞与这些抑制剂预孵育1小时。然后丢弃含有抑制剂的培养基，并向板中加入C6标记的纳米颗粒。孵育后，去除含药物的培养基，并用PBS洗涤细胞三次。细胞用4%甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤三次。用荧光显微镜观察细胞内的荧光分布。使用ImageJ软件分析荧光强度。最后，比较不同抑制剂处理组的细胞内吞效率以确定主要的细胞摄取机制。2.3.4 体外药代动力学研究2.3.4.1 细胞形态分析将对数生长期的细胞接种到6孔板中并培养至达到适当的细胞密度。向板中加入含有等效药物浓度的GEM、GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20或GEM@HA-(HAP/PSI)10的培养基，以及空白对照（仅含培养基）。在37 °C和5% CO2下孵育24小时后，去除培养基，用PBS小心冲洗细胞，并使用倒置显微镜检查形态变化。2.3.4.2 菌落形成测定以低密度（每孔1000细胞）将细胞接种到6孔板中。过夜培养后，用含有不同测试制剂（GEM、GEM@(HAP/PSI）、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20、GEM@HA-(HAP/PSI)10的无血清培养基替换培养基。孵育24小时后，使用CCK-8测定细胞活力。2.3.4.3 细胞摄取研究使用香豆素6（C6）作为荧光探针。在组装过程之前，将C6掺入PSI或HA–PSI溶液中制备C6标记的纳米颗粒。同时，将A549和H358细胞接种到24孔板的玻璃盖玻片上。附着后，用荧光标记的制剂处理细胞0.5、2和4小时。然后用4%甲醛固定细胞，并用DAPI染色，使用荧光显微镜成像。2.3.4.4 细胞摄取机制研究将A549细胞接种到24孔板的盖玻片上（每孔1 × 105细胞）并培养24小时。细胞粘附后，用含有不同内吞抑制剂的培养基替换原始培养基：氯丙嗪（CPZ，10 μg mL?1）、秋水仙碱（8 μg mL?1）或吲哚美辛（100 μM）。细胞与这些抑制剂预孵育1小时。然后丢弃含有抑制剂的培养基，并向板中加入C6标记的纳米颗粒。孵育后，去除含药物的培养基，并用PBS洗涤细胞三次。细胞用4%甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤三次。用PBS洗涤细胞，并用DAPI染色细胞核5分钟。使用荧光显微镜观察细胞内的荧光分布。2.3.4.5 体内药代动力学研究2.3.4.1 动物模型建立将A549细胞在含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。收获对数生长期的细胞，并将其皮下注射到Balb/c-NU裸鼠的右腋下以建立异位异种移植肿瘤模型。2.3.5.2肿瘤抑制实验
当肿瘤体积达到约100 mm3时，携带肿瘤的小鼠被随机分为三组（每组n = 6只）：盐水对照组、游离GEM组和GEM@HA-(HAP/PSI)10组。治疗通过尾静脉注射进行，每2天一次，共持续14天。定期测量肿瘤大小和体重。最后一次注射后，所有小鼠都被安乐死。切除它们的肿瘤和主要器官，称重并拍照以分析肿瘤重量。同时，组织被固定在4%的甲醛中以备后续实验使用。

2.3.5.3. 苏木精和伊红（H&E）染色
固定的肿瘤和器官组织经过脱水、石蜡包埋和切片处理。组织切片依次在二甲苯中脱蜡（I、II，各20分钟），通过分级乙醇系列重新水化（100% I & II，5分钟；90%，5分钟；80%，5分钟；70%，5分钟），然后用蒸馏水冲洗。切片用苏木精染色5分钟，用水冲洗，再用伊红复染1-2分钟，最后用升阶梯度乙醇系列脱水，用二甲苯透明处理，并在中性树脂中封片。染色后的切片在光学显微镜下观察。

2.3.5.4. TUNEL染色
按照上述方法对制备好的组织切片进行脱蜡和重新水化。然后使用蛋白酶K处理进行抗原修复，再用PBS冲洗（2-3次）。将TUNEL反应混合物施加到切片上，然后在37°C下避光孵育60分钟。用PBS冲洗（每次5分钟，共三次）后，将切片封入含有DAPI的抗褪色封片剂中。通过荧光显微镜检测和成像凋亡细胞。

3. 结果与讨论
3.1. HA–PSI的结构
图1A–E显示了不同配方的1H核磁共振（1H NMR）谱图，其特征质子信号已明确标注。峰a（δ = 1.48 ppm，图1C–E）归因于HA–PSI结合物中六亚甲基二胺间隔区的亚甲基质子（–CH2–）。峰b（δ = 1.7 ppm，图1A, C–E）来自HA骨架中的N-乙酰基的甲基质子（–NHCOCH3）。
峰c（δ = 2.69 ppm和2.85 ppm，图1B–E）归因于PSI重复单元的亚甲基质子（–CH2–），其分裂模式是由于相邻的手性中心造成的。
峰d（δ = 3.3 ppm，图1A, C–E）对应于HA中的葡萄糖醛酸残基上的质子。峰f（δ = 5.25 ppm，图1B–E）归因于PSI中琥珀酰亚胺环内的亚甲基质子（–CH–）。
值得注意的是，观察到一个新的峰e（δ = 4.5 ppm，图1C–E），其化学位移与HA–PSI结合物中新形成的酰胺键（–N–CH–CO）相邻的亚甲基质子一致。这些发现直接证明了HA和PSI的成功结合。

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图1. HA、PSI及HA–PSI结合物的合成与表征。
(A–E) HA（A）、PSI（B）、HA–PSI40（C）、HA–PSI20（D）和HA–PSI10（E）的质子核磁共振（1H NMR）谱图（在DMSO-d6中）。
(F) HA、PSI及HA–PSI结合物（HA–PSI40、HA–PSI20和HA–PSI10）的傅里叶变换红外（FT-IR）谱图。
(G–K) PSI（G）、HA（H）及HA–PSI结合物（HA–PSI40 [I]、HA–PSI20 [J]和HA–PSI10 [K]）的热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）曲线。
(L) HA、PSI及HA–PSI40结合物的X射线衍射（XRD）图谱。

HA的FT-IR谱图（图1F）包含一个宽而强的吸收峰，中心位于3421 cm?1，对应于分子间氢键中的O–H伸缩振动。1617 cm?1和1408 cm?1的明显峰分别归因于羧酸基团（CO）的不对称和对称伸缩振动。1045 cm?1的吸收峰归因于伯醇的C–O伸缩振动。
在PSI中，2955 cm?1的吸收峰主要是由于亚甲基基团（–CH2–）的C–H伸缩振动。1792 cm?1的峰是由相邻羰基的耦合产生的，而1717 cm–1的强峰对应于琥珀酰亚胺环的CO伸缩振动。此外，1392 cm–1的吸收峰与酰亚胺环内的C–N伸缩振动相关，证实了五元环状酰亚胺结构的存在。
重要的是，合成的HA–PSI结合物的FT-IR谱图中出现了新的吸收峰，分别位于1638 cm?1和1542 cm?1，这些峰是酰胺I（主要是CO伸缩）和酰胺II（N–H弯曲和C–N伸缩的组合）的特征。这些酰胺信号的出现证实了PSI的开环及其与HA的结合。

通过TGA/DTG（图1G–K）研究了这些配方的热降解行为。PSI（图1G）表现出三阶段分解行为：在190°C以下初始重量损失8.81%（自由水的蒸发）；在255°C至385°C之间为主要重量损失阶段（27%重量损失，涉及末端–OH/–NH2基团的脱水），在334°C达到峰值；最后从386°C到610°C为第三阶段（15.16%重量损失，骨架断裂）。
HA（图1H）在130°C以下显示4.94%的重量损失（水分损失），随后在150°C至310°C之间迅速分解（42.7%重量损失），在211.7°C达到峰值（表明多糖链断裂）。这些结果表明PSI的热稳定性优于HA，这归因于其刚性的环状酰亚胺结构。有趣的是，HA–PSI结合物的TGA曲线（图1I–K）显示随着HA含量的增加，最大分解温度系统性地降低：303.5°C（HA–PSI40）、253.9°C（HA–PSI20）和210.9°C（HA–PSI10）。这种趋势接近纯HA的降解温度，不能仅用简单的物理混合或稀释效应来解释，因为这些效应通常会导致峰宽化而不是方向性移动。
相反，这是由于HA对PSI的环状酰亚胺环的亲核攻击，导致环的开环和刚性环状结构转化为更灵活的线性片段。这种化学转变降低了骨架分解所需的活化能，从而在较低温度下引发降解。与此一致的是，HA–PSI40、HA–PSI20和HA–PSI10在150–310°C范围内的重量损失分别为33.11%、36.83%和38.55%，与HA含量呈正相关。复合材料的双峰曲线进一步证明了化学相互作用而非物理混合。降低的热稳定性表明HA–PSI结合物在生理条件下（37°C）可能降解更快，有利于药物释放动力学。
此外，环的开环反应由于生成了酰胺键和羧酸基团，增强了系统的亲水性，可能改善了膨胀能力并影响了药物装载和释放特性。从刚性环状结构到柔性线性结构的转变也可能降低机械强度，同时可能增加韧性。

XRD图谱（图1L）显示，PSI和HA在2θ = 20.18°和19.47°处分别呈现宽而模糊的晕圈，这是无定形聚合物的特征。HA–PSI复合材料的XRD图谱在2θ = 17.05°和29.25°处有两个新的宽峰，其形状和位置与单独组分不同。这反映了HA和PSI之间的分子级相互作用，导致聚合物链的重排和形成新的均匀相，而不是物理混合物。峰位的变化反映了层间距离（d）的变化。17.05°处的峰（较大的d间距）反映了某些区域链间距离的扩大，可能是由于HA（例如–COOH、–OH）的极性基团通过氢键插入PSI或HA链之间。相反，29.25°处的峰（较小的d间距）表明其他区域的链排列更紧密，可能是由于链的重折叠或相互作用引起的局部有序。复合材料的均匀无定形晕圈表明在整个样品中存在广泛的均匀相互作用。d间距减小的区域可能增强复合材料的结构紧凑性和稳定性，而d间距增大的区域可能为药物装载和扩散提供更多间隙。复合材料的无定形性质有利于作为药物载体的可控溶解/膨胀行为。XRD结果证实HA–PSI是一种通过分子间相互作用形成的具有独特均匀结构的无定形复合材料。

附加表征：HA–PSI反应时间的确定显示在图S2（补充信息）中。HAP的结构表征显示在图S3（补充信息）中。

3.2. 纳米药物输送系统的优化
单因素实验的结果总结在表S1–S3中。每种纳米配方的优化结果及相应分析提供在表S4和S5中，响应面图显示在图2中。结果表明，HAP和药物（GEM）的浓度对纳米配方的DLC和EE都有显著影响。每种配方的最佳组成列在表1中。值得注意的是，所有纳米配方的DLC均达到约30%或更高。这种高装载能力至关重要，因为它可以减少所需辅料的量，降低生产成本，并改善配方的安全性。对于需要高剂量药物治疗的疾病（如癌症），这一优势尤为宝贵。

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图2. 使用三维响应面方法进行配方优化。
(A) GEM@(HAP/PSI)；(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40；(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20；(D) GEM@HA-(HAP/PSI)10。

表1. 配方优化结果及最终配方的封装效率和药物装载量（n = 3）
a,b
纳米制剂 C GEM (mg/mL) C HAP (mg/mL) m PSI:mHAP
预测EE (%) 预测DLC (%) 测量EE (%) 测量DLC (%)
GEM@(HAP/PSI) 39.55 5.87 5.58 56.26 36.98 56.68 ± 2.31 37.07 ± 0.60
GEM@HA-(HAP/PSI) 38.60 5.57 6.00 56.02 35.11 56.63 ± 1.03 34.95 ± 1.19
GEM@HA-(HAP/PSI) 39.39 5.67 8.00 70.55 33.26 71.93 ± 0.14 34.21 ± 0.24
GEM@HA-(HAP/PSI) 40.45 5.99 10.00 68.31 29.07 72.73 ± 2.86 30.14 ± 0.74

a缩写：C，浓度；GEM，吉西他滨；HA，透明质酸；PSI，聚琥珀酰亚胺；HAP，羟基磷灰石；EE，封装效率；DLC，药物装载量。
bEE = M1 × 100/M0 和 DLC = M1 × 100/(M1 + M2)。M1是载体中的药物质量，M0是添加药物的总质量，M2是空白载体的总质量，GEM标准曲线显示在图S1中。

3.3. 纳米药物输送系统的表征
如图3A–D所示，最终纳米配方均表现出相对均匀且接近球形的形态。GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的粒径分别为133.6 nm、159.4 nm、170.1 nm和184.6 nm。此外，所有配方的多分散指数较低。纳米粒子的尺寸范围（约100–200 nm）在利用EPR效应和实现被动靶向所需的最佳范围内。因此，这些粒子可以有效规避快速肾清除的挑战（通常影响小于10 nm的粒子），同时保持小于肿瘤血管内皮间隙（通常为200–2000 nm），从而促进其在肿瘤部位的选择性积累。此外，它们的尺寸范围可以最小化肝脏和脾脏中单核吞噬细胞的过度摄取（这些细胞优先清除大于200 nm的粒子），延长系统循环时间并增加药物向目标组织的输送机会。
低多分散指数表明粒子的尺寸分布狭窄。这反映了制备过程的稳定性和可重复性，这对于批次间一致性和未来的临床转化至关重要。
纳米粒子的ζ电位约为?18 mV，这是一个中等负值，与人类生物膜的负电荷一致。

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图3. 各纳米配方的物理化学表征和体外药物释放曲线。
(A–D) 不同配方的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像、粒径分布（PSD）和ζ电位：(A) GEM@(HAP/PSI)；(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40；(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20；(D) GEM@HA-(HAP/PSI)10。
图3E展示了不同pH条件（5.0、6.8和7.4）下各种配方的体外药物释放曲线。24小时后，GEM@(HAP/PSI)在pH 5.0、6.8和7.4下的累积药物释放率分别达到了约41%、58%和60%。经过HA修饰后，GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的药物释放速率增加，在pH 7.4下的24小时释放率分别为64%、69%和79%；在pH 6.8下分别为62%、66%和75%；在pH 5.0下分别为43%、47%和49%。所有制剂都表现出明显的pH依赖性释放特性，在pH 5.0下释放速率明显减慢且不完全。有趣的是，GEM@HA-(HAP/PSI)10在最初的12小时内释放速率比GEM@HA-(HAP/PSI)20慢，但之后其释放速率超过了其他所有制剂。这种双相释放模式可能归因于GEM@HA-(HAP/PSI)10表面的密集HA刷状结构。最初，水合的HA层阻碍了水分的渗透，从而阻止了药物的释放。然而，当水分穿透屏障后，较高的HA含量促进了PSI基质的快速降解，加速了后期的药物释放。在pH 7.4下观察到的加速和更完全的药物释放是由于PSI骨架中存在大量的琥珀酰亚胺环（五元环状酸酐），这些环在碱性条件下极易水解。在这些pH条件下，高浓度的强亲核氢氧根离子（OH?）促进了这些环的有效攻击和断裂，导致聚合物骨架的快速水解，随后纳米颗粒解体，药物释放加快。相比之下，在酸性条件下，高浓度的H+和有限的OH?限制了水解，水解主要通过水分子（H2O）进行。由于水的亲核性相对较弱，琥珀酰亚胺环的水解显著减慢，使得纳米颗粒保持了更大的结构完整性。这导致了更持续且更缓慢的药物释放。

尽管大多数实体瘤的细胞外微环境呈弱酸性（pH约6.5–7.0），但肿瘤细胞的细胞内pH接近中性或略偏碱性（约7.2–7.4），与正常细胞相当或略高。因此，对于在细胞质或细胞核内起作用的治疗药物（例如GEM），能够在pH 7.4下快速释放药物的系统具有优势。这样的系统在细胞摄取后促进药物的有效释放，从而增强细胞毒性效果。这种提出的释放机制与典型的细胞内转运途径一致。内吞作用后，纳米颗粒被包裹在内体中。随着这些囊泡成熟并与溶酶体融合，其内腔pH从大约6.5降至5.0。基于PSI的载体在这些酸性内溶酶体条件下的稳定性有助于保护封装的药物免受过早降解。随后，当纳米颗粒逃离内溶酶体区室或暴露于接近中性的细胞质pH（约7.4）时，它们会迅速解体，触发药物向细胞质的爆发性释放。这种pH触发的释放机制对于大分子治疗药物（例如核酸和蛋白质）的递送特别有益，因为这些药物容易受到溶酶体的降解，需要有效的细胞质释放才能发挥其生物作用。

这些制剂的药物释放曲线被拟合到各种动力学模型中，包括零级、一级、Higuchi和Korsmeyer–Peppas模型。如表2所示，Korsmeyer–Peppas模型对大多数制剂组显示出最高的相关系数（R2）。一个例外是在pH 6.8和7.4下的GEM@HA-(HAP/PSI)10，其中一级模型提供了略微更好的拟合。从Korsmeyer–Peppas模型得到的释放指数（n）始终低于0.4，明确表明药物释放机制主要由Fickian扩散控制。这种机制在测试的pH范围内的均匀性表明，pH变化没有引起载体的根本性变化，如显著的聚合物侵蚀或基质解体。

表2. 不同制剂药物释放动力学的拟合参数

制剂 | 中间值 | R2 | n | 零级 | 一级 | Higuchi | Korsmeyer-Peppas |
|------|------|------|------|------|------|------|
| GEM@(HAP/PSI)|pH 7.4|0.845|50.96|150.96|760.98|140.40|37|
| |pH 6.8|0.839|10.97|120.96|360.97|60.41|27|
| |pH 5.0|0.863|0.97|190.97|370.98|030.44|23|
| GEM@HA-(HAP/PSI)40|pH 7.4|0.837|30.94|440.96|420.98|340.37|68|
| |pH 6.8|0.838|10.96|680.96|430.97|880.40|60|
| |pH 5.0|0.876|0.95|070.97|900.98|650.42|24|
| GEM@HA-(HAP/PSI)20|pH 7.4|0.772|70.94|400.92|800.96|610.33|64|
| |pH 6.8|0.807|10.95|550.94|800.97|260.37|32|
| |pH 5.0|0.831|80.96|900.96|070.97|480.41|12|
| GEM@HA-(HAP/PSI)10|pH 7.4|0.743|0.97|930.90|290.92|940.38|01|
| |pH 6.8|0.755|60.98|820.91|170.93|240.40|14|
| |pH 5.0|0.841|90.95|510.96|620.98|180.39|66|

值得注意的是，Fickian扩散控制的过程（n < 0.45）表明制剂的释放速率主要由载体基质内的药物浓度梯度决定，分子通过孔隙或水通道向外扩散。较低的n值有效地排除了由聚合物链松弛或膨胀（Case-II或异常运输）控制的可能性。总体而言，以扩散为主的释放曲线似乎是有利的，因为它通常提供更渐进和可预测的释放动力学，从而最小化了与快速载体降解相关的初始爆发性释放的风险。这种受控释放对于维持稳定的治疗药物水平和减轻毒性通常至关重要。在这项研究中，纳米载体在生理pH范围（5.0–7.4）内表现出稳健的物理和化学稳定性，作为稳定的储存库而不发生快速溶解。这一特性可以实现长时间的持续药物释放，延长治疗效果，并可能通过减少给药频率来提高患者的依从性。对于需要通过磷酸化在细胞内激活的前体药物（如GEM），持续的释放曲线有助于维持相应活性代谢物的有效浓度，可能对抗某些代谢相关的耐药机制。在不同制剂中一致观察到Fickian扩散作为主要释放机制，表明纳米载体的核心释放行为是稳健的，并且基本上不受制备参数（如HA含量）的影响。这些特性可能有利于未来的放大生产和质量控制。

总之，本研究中制备的纳米平台表现出理想的、由扩散控制的释放曲线。其稳定的结构可以通过调节扩散速率来促进持续释放，同时防止结构崩溃。值得注意的是，释放指数（n）随着HA修饰的增加而减小。更密集的HA水合层最初可能作为扩散屏障，调节初始释放阶段。随后的水分渗透可能改变了聚合物基质的膨胀和渗透性，从而在后期增强了以扩散为主的特点。特别是对于GEM@HA-(HAP/PSI)10制剂，在pH 7.4和6.8下的释放遵循一级动力学，这通常是扩散控制过程的特征，其中释放速率与剩余的药物负荷成正比。这些发现反映了载体在该pH范围内的相对结构稳定性，聚合物膨胀或降解的贡献最小。在pH 7.4和6.8下稍高的n值可能表明存在轻微的基质侵蚀过程。然而，在中性pH下的一级动力学表明了可预测的释放行为，这对系统循环期间的稳定性有益。同时，在酸性pH条件下的Fickian行为（n < 0.45）证实了纳米载体的结构完整性以及没有过度膨胀，支持它们适用于细胞内递送。最后，一级和Higuchi模型在所有纳米制剂上的高相关系数（R2 > 0.94）也证实了以扩散为主的释放机制，因为这些模型广泛用于描述扩散控制系统。

3.4. 生物相容性和细胞毒性评估
体外溶血试验的结果显示在图4A–D中。共培养后，GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10组的上清液清澈无色，试管底部有明显的红细胞（RBC）沉淀。这些样品的轮廓与阴性对照无异，与溶血的阳性对照明显不同。如图4E所示，所有制剂组的溶血率均低于2%，证实了这些制剂的优异生物相容性。这表明纳米颗粒在测试条件下没有破坏红细胞的完整性。通常，溶血是由纳米材料的表面活性、疏水性、尖锐边缘或强正电荷等因素引起的，这些因素可能导致膜破裂。纳米颗粒观察到的生物相容性与它们适度的负ζ电位（约-18 mV）一致，这可能减少了与带负电的红细胞膜的静电吸附，并防止了由于纳米颗粒聚集引起的任何物理应力或渗透压不平衡。这些结果表明，在测试的浓度范围内，这些制剂对红细胞的影响最小，溶血风险低，为后续分析提供了可靠的安全基础。

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图4. 纳米制剂的生物相容性和体外安全性。(A–D) 与(A) GEM@(HAP/PSI)、(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40、(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20和(D) GEM@HA-(HAP/PSI)共培养的红细胞的代表性图像。(E) 溶血率的量化。使用细胞活力测定法评估空白载体对(F) A549和(G) H358细胞的体外细胞毒性。

如图4F和G所示，用不同浓度空白载体处理的A549和H358细胞的细胞活力始终超过85%。这表明纳米载体具有良好的生物相容性，对这两种细胞系均无内在细胞毒性，对细胞生长和代谢的影响可以忽略不计。空白载体的主要非毒性确保了随后实验中观察到的任何抗肿瘤效应可以可靠地归因于释放的GEM，而不是载体材料的非特异性细胞毒性。此外，具有不同程度HA修饰的载体也显示出低毒性，证实HA conjugation过程是安全的，没有引入意外的细胞毒性。鉴于载体的固有安全性，载药制剂的抑制效应更准确地反映了GEM的递送效率和治疗效果，从而确保了后续基于细胞的实验的可靠性和可解释性。此外，优异的生物相容性和低细胞毒性共同表明这些纳米颗粒不太可能引起显著的急性炎症反应或在系统给药时对正常组织产生毒性。

3.5. 细胞内化机制的研究
首先使用CCK-8测定法评估了游离GEM和纳米制剂GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的体外抗增殖效应。如图5A和B所示，两种细胞系的细胞活力随着GEM浓度的增加而降低，呈剂量依赖性。此外，所有纳米制剂都比游离GEM提供了更强的生长抑制作用，其中HA修饰的变体（GEM@HA-(HAP/PSI)40/20/10的效力略高于非靶向变体GEM@(HAP/PSI)。

图5. 体外细胞毒性、细胞摄取和内化机制。(A和B) 用不同浓度纳米制剂处理的(A) A549和(B) H358细胞的细胞活力。(C和D) 对(C) A549和(D) H358细胞的半数抑制浓度（IC50）值。(E和F) 显示(A) A549和(F) H358细胞中细胞摄取的代表性荧光显微镜图像。(G和H) 基于平均荧光强度（MFI）检测的细胞摄取量化。(I和J) 在A549细胞中研究摄取机制。(a) GEM@(HAP/PSI); (b) GEM@HA-(HAP/PSI)40; (c) GEM@HA-(HAP/PSI)20; (d) GEM@HA-(HAP/PSI)10。数据以平均值±标准差（n ≥ 3）表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

半数抑制浓度（IC50）值总结在图5C和D中。24小时处理后，A549细胞中游离GEM、GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的IC50值分别为21.59、16.08、10.19、8.03和6.24 μg/mL。同时，H358细胞中的相应值分别为22.01、17.19、12.62、11.21和9.63 μg/mL。这些结果表明，所有载药纳米颗粒的IC50值均低于游离GEM，证实纳米递送系统显著增强了GEM对肺癌细胞的细胞毒性效应。这种增强可能归因于纳米载体通过内吞作用更有效的细胞内化、GEM免受细胞外降解的保护以及持续的细胞内释放，这些因素共同增加了并维持了有效的药物浓度。对于A549细胞，IC50值随着HA浓度的增加而降低，表明药物效力与HA修饰的密度呈正相关。这表明较高的HA配体表面密度可能促进与CD44受体的更强、潜在的多价相互作用，从而实现更有效的受体介导的摄取。这些发现与TGA和XRD分析的结果一致，这些分析显示随着HA含量的增加，化学修饰和交联增加，可能优化了细胞内药物释放动力学。对于具有相同HA修饰水平的制剂，A549细胞中的IC50值始终低于H358细胞。这不仅反映了A549细胞中较高的CD44表达，还直接证明了HA修饰纳米颗粒的细胞毒性依赖于CD44受体介导的途径。尽管如此，即使在表达低水平CD44的H358细胞中，HA修饰的配方仍然显示出比非靶向配方更低的IC50值。这种残余活性可能是由于低水平的受体相互作用和被动靶向效应共同作用的结果，而HA修饰组之间的差异可能归因于药物释放特性的不同。为了可视化纳米药物的细胞摄取情况，使用了C6作为荧光探针并将其掺入纳米颗粒中。如图5E和F所示，C6标记的纳米颗粒发出绿色荧光，而细胞核由于DAPI染色而呈现蓝色。在CD44高表达的A549细胞中（图5E和G），在0.5小时时所有组都检测到微弱的绿色信号，表明纳米配方已经开始进入细胞。此后，荧光强度在2小时时显著增加，反映了内化的增强。此外，荧光强度在4小时时达到峰值，并且在6小时时仍然很强，没有明显的减弱。这种随时间增加的荧光强度表明了纳米颗粒在细胞内的持续积累，而不仅仅是表面吸附。6小时时持续的信号表明纳米颗粒在细胞内的有效保留，这对延长药物释放时间是有利的。值得注意的是，HA修饰的纳米颗粒（HA-(HAP/PSI)40、HA-(HAP/PSI)20和HA-(HAP/PSI)10的荧光强度始终高于非靶向（HAP/PSI）配方。此外，信号强度与HA修饰的密度呈正相关（图5G），这意味着更高的HA配体表面密度导致更大的细胞内化。这一视觉证据直接支持了HA的主动靶向功能，并与CCK-8实验中观察到的增强细胞毒性效果一致，表明HA-(HAP/PSI)10具有最有效的靶向和递送特性。相比之下，在CD44低表达的H358细胞中（图5F和H），所有时间点的荧光信号都很弱。虽然HA修饰的配方显示出略高的荧光强度，但差异很小，不同HA修饰组之间没有显著差异。这与A549细胞中的摄取模式形成鲜明对比，表明HA修饰的有益效果高度依赖于CD44受体的表达。总之，研究结果表明，HA修饰显著增强了目标细胞（A549）对纳米颗粒的摄取，这种增强作用与时间和HA比例有关，主要通过CD44受体介导的途径实现。在CD44高表达的A549细胞中，荧光的显著增强与其在CD44低表达的H358细胞中的微弱效果形成对比，证实了所设计的纳米载体的靶向特异性和受体驱动机制。

基于细胞摄取观察结果，我们进一步探讨了主要配方GEM@HA-(HAP/PSI)10在A549细胞中的内吞机制。非病毒纳米载体通常通过内吞作用进入细胞，并在囊泡内被内化，随后囊泡成熟为内体。哺乳动物细胞具有几种不同的内吞途径，包括网格蛋白介导的内吞（CME）、caveolin介导的内吞、巨噬作用以及不依赖于网格蛋白/caveolin的机制。纳米颗粒的摄取途径和效率受多种因素影响，包括颗粒大小、表面电荷、材料组成和表面配体。通常，内化是通过多种途径的组合而不是单一途径发生的。因此，为了明确主要摄取机制，在与C6标记的纳米颗粒孵育之前，先用特定的药理学抑制剂处理A549细胞。如图5I和J所示，氯丙嗪（CME抑制剂）显著抑制了纳米颗粒的细胞摄取，降至对照水平的62.06%。这种显著降低（约38%的抑制）表明CME是这些细胞中GEM@HA-(HAP/PSI)10摄取的主要途径。在CME途径中，货物通常通过早期和晚期内体转运到溶酶体。在这种情况下，我们的纳米载体在酸性溶酶体pH下的缓慢药物释放特性可以保护有效载荷免受酶降解，这对于输送如核酸等不稳定的治疗剂具有潜在优势。值得注意的是，吲哚美辛（caveolin介导的内吞抑制剂）也部分抑制了纳米配方的细胞摄取，降至对照水平的86.56%（约13%的抑制），表明该途径也起到了一定作用。caveolin介导的内吞通常可以绕过溶酶体降解，可能将货物导向其他细胞内区室，如高尔基体或内质网。最后，秋水仙碱（巨噬作用抑制剂）处理后，摄取量仅略微降低至对照水平的93.02%（约7%的抑制），表明这种非特异性液相摄取机制的作用有限。总之，我们的结果表明GEM@HA-(HAP/PSI)10纳米颗粒主要通过CME进入A549细胞，caveolin介导的内吞和巨噬作用作为次要途径。这种多种进入机制的参与可能是有利的，可能通过绕过任何单一摄取途径来降低细胞耐药性的可能性。

3.6 体外抗肿瘤效果
如图6A所示，空白对照组的A549细胞显示出典型的多边形形态，并保持良好的粘附性和活力。相比之下，用游离GEM处理的细胞仅显示出轻微的形态变化，基本保持了结构完整性。而用GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10处理的细胞则显示出明显的改变：细胞明显收缩，失去了原有的多边形形状，细胞密度显著下降。

3.7 体内抗肿瘤活性和药效学评估
基于我们在体外药效学的研究结果，我们进一步在异种移植小鼠模型中评估了GEM@HA-(HAP/PSI)10的体内抗肿瘤效果。使用商业可获得的GEM配方（Eli Lilly and Company）和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照。如图7A和B所示，经过15天的治疗后，GEM和GEM@HA-(HAP/PSI)10组的肿瘤体积显著小于生理盐水对照组，表明有效抑制了肿瘤生长。值得注意的是，GEM@HA-(HAP/PSI)10显示出最强的抗肿瘤效果。定量分析（图7C）证实，HA修饰的纳米配方比游离GEM更有效地抑制了肿瘤生长。值得注意的是，所有药物处理组与正常组之间的小鼠体重相当（图7D），这表明所制备的纳米制剂在给药剂量下具有良好的生物相容性和极低的急性全身毒性。下载：下载高分辨率图像（6MB）下载：下载全尺寸图像图7. 在异种移植小鼠模型中的体内抗肿瘤效果。(A) 治疗期结束时的小鼠代表性照片。(B) 来自每个治疗组的小鼠切除的肿瘤。(C) 肿瘤生长曲线。(D) 治疗过程中携带肿瘤的小鼠体重变化。(E) 通过苏木精和伊红（H&E）染色对肿瘤组织进行组织病理学评估。(F) 肿瘤组织的TUNEL染色（绿色：TUNEL阳性的凋亡细胞；蓝色：DAPI染色的细胞核）。(a) 生理盐水，(b) 游离GEM，(c) GEM@HA-(HAP/PSI)10。数据以平均值±标准差表示（n ≥ 3）。***p < 0.001，****p < 0.0001。H&E染色（图7E）显示，与对照组相比，游离GEM和载GEM的纳米制剂（GEM@HA-(HAP/PSI)10）处理后的肿瘤组织存在明显的组织病理学改变。在生理盐水组（图7E(a)）中，肿瘤细胞表现出高度密集、单态的增殖模式，其特征是核质比高和核染色深。由于间质成分极少，细胞以固体、背靠背的片状形式生长。这种形态是未经治疗的高度增殖性肿瘤的典型特征，其中均匀的细胞结构反映了强烈的克隆扩增，没有证据表明有治疗引起的分化或坏死。在游离GEM组（图7E(b)）中，观察到整体细胞密度有所降低。组织中散布着小而无结构的嗜酸性区域，表明早期或局部的肿瘤细胞坏死。虽然剩余的活细胞仍保留一定程度的非典型性，但活跃增殖的迹象减少了。这些发现表明游离GEM具有有限且不均匀的细胞毒性，导致部分肿瘤细胞死亡。值得注意的是，在游离GEM组中没有检测到广泛的显著空泡化。相比之下，GEM@HA-(HAP/PSI)10组（图7E(c)）呈现出明显不同的组织病理学特征，以大量透明空泡为主，细胞分布较为稀疏。这些“幽灵”轮廓是凝固性坏死的特征，表明细胞发生了广泛的解体。残留的肿瘤细胞巢呈碎片化和稀疏状态，表明肿瘤细胞死亡广泛且协调（包括坏死和凋亡），以及严重的结构破坏。值得注意的是，大面积融合坏死区域的存在是强效化疗效果的黄金标准病理指标。纳米制剂组中检测到的广泛空泡化和坏死表明GEM@HA-(HAP/PSI)10通过EPR效应和/或主动靶向作用促进了GEM在肿瘤组织中的更深层和更有效的积累。细胞密度的显著降低反映了整体肿瘤负担的显著减少和增殖活性的抑制。为了进一步评估体内抗肿瘤机制，对肿瘤组织进行了TUNEL/DAPI染色以检测凋亡（图7F和G）。在生理盐水组（图7F(a)）中，TUNEL（红色）通道显示出强烈的红色荧光信号，表明DNA广泛片段化，因此存在活跃的凋亡。同时，DAPI（蓝色）通道显示高密度的细胞核。红色信号与蓝色细胞核（呈现粉红色/紫色）在合并图像中的广泛共定位证实了这些凋亡事件发生在肿瘤细胞内。根据文献，在快速生长、高度拥挤的未经治疗的肿瘤中，严重的营养竞争和缺氧微环境可以触发一部分细胞的“自发凋亡”。然而，由于增殖率远高于凋亡率，整体肿瘤质量继续扩大。因此，该组中的强烈TUNEL信号反映了“高周转率”和内部紊乱（即由于未受干扰肿瘤的内部压力引起的“背景凋亡”，而不是有效的治疗反应。在游离GEM组（图7F(b)）中，TUNEL红色信号的强度和密度低于生理盐水组，但仍可清晰识别。合并图像也显示共定位信号减少。这表明游离GEM有效干扰了DNA合成，诱导了一部分肿瘤细胞的凋亡，并可能清除了一些细胞，产生了明确的药理效应。然而，可能由于药物递送效率不佳和肿瘤异质性等因素，凋亡诱导是局部的和不完全的，未能摧毁大部分肿瘤组织。这与H&E染色切片中缺乏大面积坏死区域的结果一致。然而，GEM@HA-(HAP/PSI)10组（图7F(c)）表现出最独特的表型。TUNEL红色信号在这一组中变得极其微弱和稀疏，几乎达到背景水平。这表明细胞可能正在经历其他形式的死亡，如坏死或焦亡，或者凋亡细胞可能在死亡程序完成后迅速被清除，阻止了TUNEL可检测信号的积累。这一观察结果与H&E染色（图7E(c)）中观察到的广泛坏死区域完全一致，共同证明了纳米制剂引发了更彻底和广泛的肿瘤组织解体。总之，GEM@HA-(HAP/PSI)10纳米制剂的抗肿瘤效果明显优于本研究中测试的市售GEM制剂（游离GEM）。更好的结果可能源于纳米制剂的综合优势：HA介导的针对CD44表达肿瘤细胞的主动靶向，由于适当的纳米尺寸（约185纳米）而通过EPR效应实现的被动积累，以及在肿瘤微环境或细胞区室内的pH响应性药物释放。市售的GEM制剂作为游离药物，在体内非特异性分布，迅速被清除，并在肿瘤组织中仅实现有限的积累。因此，它只能诱导局部的和不完全的肿瘤杀伤效果。相比之下，GEM@HA-(HAP/PSI)10纳米载体由于HA的CD44靶向能力和其最佳尺寸，通过EPR效应和主动靶向在肿瘤部位实现了高效积累。这种积累可能源于以下因素的结合：(i) HA–CD44结合，有助于纳米颗粒在系统循环期间锚定在CD44表达的肿瘤细胞上；(ii) EPR效应与受体介导的内吞作用之间的协同作用，使得在组织和细胞水平上实现更高程度的双重靶向。这导致肿瘤内的局部药物浓度显著增加，从而产生更强大和广泛的肿瘤杀伤作用。此外，纳米载体可能保护了GEM，减少了其在血液中的快速代谢脱氨和失活，并且可以通过内吞途径绕过某些膜转运蛋白介导的耐药机制。这种延长的药物作用可能有助于更深刻和持续的肿瘤细胞死亡，病理上表现为大面积的组织解体，而不是零星的局部坏死。尽管已经开发了大量的纳米载体，但它们的临床转化仍然有限。自1995年第一个聚乙二醇化多柔比星脂质体Doxil?获得批准以来，到2023年底只有大约90种纳米药物上市，其中一些随后被撤回。目前，临床使用和正在临床研究的纳米载体主要是被动靶向的脂质基系统。虽然这些纳米药物与传统制剂相比提高了患者的依从性，但大多数在临床效果上没有显著提升。同时，更精确的靶向递送系统，如采用主动靶向策略的系统，在临床开发过程中经常遇到重大瓶颈并面临转化挑战。在这种情况下，主要障碍包括纳米颗粒在长期稳定性、有效性和安全性方面的固有局限性；可药用载体材料的有限选择；以及与工业规模制造、包装和成本效益相关的挑战。先进递送系统（例如主动、物理或化学靶向）的设计、合成和制备通常很复杂，导致难以实现可重复的规模化生产、严格的杂质/质量控制以及适当的灭菌和物理化学稳定性。这些问题共同构成了从功能性纳米载体的开发到其成功工业和临床转化的关键障碍。在这方面，本研究中开发的GEM@HA-(HAP/PSI)纳米靶向递送系统与传统脂质体制剂相比具有几个潜在的优势。这些优势包括相对较低的生产成本（由于使用了廉价原材料）、简单的制备过程（不需要严格条件或特殊设备）、产生的杂质最少、在辅料生产过程中可以整合灭菌、终端灭菌容易、以及相当的过程稳健性（在一定范围内的进料量变化不会影响产品质量）。此外，该系统的DLC至少为300 mg g?1。因此，从临床角度来看，该平台非常有前景。通过调节壳材料、核心组成和颗粒大小，该系统可以适应不同的靶向方式（被动、主动、物理或化学），并适用于多种给药途径，包括口服、吸入、植入和注射。总体而言，这种递送系统似乎特别适合体内递送抗肿瘤剂和基于核酸的基因治疗药物。4. 结论在这项研究中，基于CD44受体介导的主动靶向策略，我们成功开发了一种HA修饰的纳米载体共递送系统，称为GEM@HA-(HAP/PSI)，用于封装GEM。所得纳米颗粒具有球形形态、均匀分布和适度的负表面电荷。体外细胞摄取研究表明，该系统可以通过HA–CD44受体相互作用有效增强在CD44过表达的肺癌细胞中的细胞内积累，从而证实了其主动靶向能力。更重要的是，体内抗肿瘤效果评估表明GEM@HA-(HAP/PSI)比游离GEM或市售GEM制剂提供了更强的肿瘤生长抑制作用。总体而言，这项研究为GEM在癌症治疗中的靶向递送提供了一种有前景的策略。作者贡献余丰波：研究、资金获取、撰写-审阅与编辑、概念化。曹静丹：研究、方法学、数据管理。范兴军：方法学、数据管理。高俊霞：方法学、数据管理。刘桂芳：研究、方法学、数据管理。朱颖：研究、方法学。王强：资金获取、撰写-初稿、数据管理。利益冲突作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。数据可用性数据将应要求提供。补充信息（SI）：(1) 吉西他滨（GEM）的UV-vis扫描光谱和标准曲线。(2) 不同反应时间点的HA-PSI HPLC色谱图。(3) HAP的FT-IR和SEM表征。(4) 自组装纳米颗粒中HA-PSI/HAP比例的SEM分析。(5) 单因素优化实验的结果。(6) GEM@(HAP/PSI)和GEM@HA-(HAP/PSI)制剂的浓度优化。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra02076c。