《Sensors and Actuators B: Chemical》：PAM-engineered abasic-site probe-assisted RPA–CRISPR platform for rapid and sensitive detection of Klebsiella pneumoniae and carbapenem-resistance genes
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吴毅|王忠忠|聂友|王梓轩|孔庆莉|严中强|周宇|郝荣章中国首都医科大学公共卫生学院毒理学与卫生化学系，北京100069摘要快速、特异性且不依赖仪器的细菌病原体和抗生素抗性基因检测在临床诊断中仍是一个主要挑战。重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a的结合是一种有前
吴毅|王忠忠|聂友|王梓轩|孔庆莉|严中强|周宇|郝荣章
中国首都医科大学公共卫生学院毒理学与卫生化学系，北京100069
摘要
快速、特异性且不依赖仪器的细菌病原体和抗生素抗性基因检测在临床诊断中仍是一个主要挑战。重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a的结合是一种有前景的分子诊断平台，但其性能受到严格依赖原间隔序列（PAM）来激活Cas12a的限制。为了解决这一限制，我们开发了一种基于PAM工程化探针辅助的RPA–CRISPR（PEAR）检测方法，在RPA过程中直接引入了结构明确的人工PAM序列。该系统使用含有非碱基位点（d’Spacer）和嵌入式PAM基序的内切酶IV（Nfo）可切割探针。当探针与目标特异性结合并经过Nfo介导的切割后，PAM序列被精确整合到新合成的扩增子中，生成含有PAM的双链DNA，有效触发Cas12a的切割活性。这种设计实现了不依赖PAM的目标适应性，同时保持了高分析灵敏度。使用质粒衍生的模板，PEAR成功检测到了肺炎克雷伯菌的khe基因和碳青霉烯类抗性基因bla_KPC-2，检测限达到1拷贝/μL，分析特异性为100%。通过对30个临床样本的评估，khe的诊断准确率为93.3%，bla_KPC-2的诊断准确率为87.7%，证明了其实际临床应用价值。总体而言，PEAR代表了一种敏感、特异性强且潜在通用的CRISPR/Cas12a介导的核酸检测平台，为消除PAM依赖性和扩展快速病原体检测及抗菌素耐药性监测的应用提供了通用策略。
引言
在现代生物传感和分子诊断中，推进快速、灵敏和准确的核酸检测具有重要意义，尤其是在资源有限的场景下。等温核酸扩增技术因其消除了复杂的热循环过程并减少了仪器依赖性而受到广泛关注[1]、[2]。其中，重组酶聚合酶扩增（RPA）技术在低温（37-42°C）下高效运行，能在短时间内实现核酸指数级扩增。它具有响应迅速、操作简单和对样本基质耐受性强等优点，特别适合与便携式生物传感平台深度集成[3]。
为了进一步提高序列特异性并减少非特异性扩增的背景干扰，RPA常与基于CRISPR的核酸识别系统结合使用[4]、[5]。特别是CRISPR/Cas12a作为一种强大的信号转导模块，在生物传感中表现出色，因为它能在目标识别时引发单链DNA（ssDNA）的切割。在crRNA的引导下，Cas12a特异性结合到双链DNA（dsDNA）目标上，发生构象变化并迅速切割荧光团-淬灭剂标记的探针，从而产生高灵敏度的实时荧光信号。因此，RPA与Cas12a的结合为开发快速、灵敏且不依赖仪器的核酸检测方法提供了有吸引力的途径。基于这一机制，已经开发出多种基于Cas12a的检测系统，例如所描述的DETECTR检测方法，它将RPA与含有PAM的dsDNA目标生成相结合，以实现高灵敏度检测[6]。
然而，RPA-Cas12a生物传感器的广泛应用受到Cas12a在目标识别过程中严格依赖原间隔序列（PAM）的限制。在传统设计中，Cas12a的激活需要扩增的dsDNA中存在特定的PAM序列，以促进crRNA结合、R环形成和随后的构象变化[7]。这一要求限制了目标区域的选择，影响了引物设计，并影响了扩增子的结构。RPA引物设计本身就需要在扩增效率、反应动力学和序列特异性之间进行仔细平衡。对精确PAM整合的更高要求进一步增加了目标选择和引物布局的复杂性，可能影响最佳扩增条件，从而可能影响整体反应效率和检测的稳健性[8]、[9]、[10]、[11]。
为了解决PAM依赖性问题，提出了几种策略来消除对PAM的需求或规避PAM的限制，包括通过不对称扩增生成ssDNA激活剂、构建具有粘性末端或发夹结构的dsDNA底物、通过延伸或尾随反应人工引入PAM序列，以及使用肽核酸或工程化引导RNA等辅助工具。虽然这些方法表明Cas12a激活可以在一定程度上绕过传统的PAM识别，但它们通常依赖于工程化底物、额外的酶促步骤或具有构象偏好的核酸结构[12]。这种额外的复杂性增加了反应设置的难度，降低了对多样化目标的适应性，并使反应条件和背景控制的优化变得复杂，最终限制了它们在实际生物传感和诊断应用中的稳健性和通用性。
与扩增后的修饰或外源激活策略不同，RPA本身提供了在扩增过程中进行可编程序列工程的内在机会。先前的研究表明，将含有AP位点（apurinic/apyrimidinic）的探针与内切酶IV（Nfo）结合使用，可以实现探针辅助的RPA系统，通过目标依赖性的探针切割和延伸显著提高特异性[13]、[14]。在该系统中，探针特异性结合到目标序列后，Nfo切割AP位点，生成一个可被RPA聚合酶延伸的3’-羟基末端。由此产生的探针片段被整合到扩增产物中，使得探针携带的序列能够以受控方式嵌入。这种机制基于序列互补性和酶促识别引入了一种条件性的整合途径，不同于简单的信号扩增或扩增后的修饰[15]、[16]。它在扩增过程中增加了额外的分子识别层，同时保持了RPA的等温和操作简便的特点，提供了一种可预测的序列原位整合机制[14]。
基于这一机制，我们开发了一种基于PAM工程化探针辅助的RPA-CRISPR检测策略（PEAR），在RPA扩增过程中实现可控的PAM整合。在这种设计中，将结构明确的PAM引导探针引入RPA反应中，而不改变原始目标序列。当探针与目标序列特异性结合后，Nfo在AP位点切割探针，生成一个含有可延伸3’-羟基末端的片段。该片段随后被RPA聚合酶延伸并整合到新合成的dsDNA扩增子中。因此，无需预先筛选目标、设计工程化引物或额外的扩增后处理步骤，就可以在原位生成可被Cas12a激活的目标分子。通过将PAM整合到扩增过程中的可控酶促整合步骤中，PEAR实现了PAM序列在扩增子中的可预测和功能一致的整合，确保了PAM与目标序列之间的正确空间邻接。与现有的绕过PAM的策略相比，PEAR减少了对引物结构工程和复杂反应流程优化的依赖，提供了一种广泛适用且可扩展的解决方案，以克服基于Cas12a的生物传感系统中的PAM限制。
为了验证PEAR平台的分析性能和应用潜力，我们将其应用于肺炎克雷伯菌及其临床关键的碳青霉烯类抗性基因bla_KPC-2的检测。肺炎克雷伯菌是一种导致严重感染和多重耐药性的关键病原体，快速检测bla_KPC-2对于抗菌素耐药性监测和制定治疗决策至关重要[17]、[18]、[19]。总体而言，PEAR策略扩展了RPA-CRISPR生物传感器的设计空间，为分子诊断中不依赖PAM的Cas12a激活提供了一种实用且可扩展的方法。
章节片段
材料与试剂
Lba Cas12a、10×NEBuffer 2.1和RNase抑制剂购自New England Biolabs（北京，中国）。肺炎克雷伯菌质粒、引物、crRNA、PAM引导探针（PAM-probe）和ssDNA报告基因（FAM-TTATT-BHQ1和FAM-TTATTATT-Biotin）由Sangon Biotech（上海，中国）合成。DNA等温快速扩增试剂盒购自Amp Future Bio-Tech Co., Ltd.（常州，中国）。内切酶IV（Nfo）购自Yeasen Biotechnology（上海，中国）。
工程化可控PAM的引入提升了基于Cas12a的CRISPR性能
由于CRISPR/Cas12a系统的切割活性严格依赖于dsDNA目标附近特定的原间隔序列（PAM，通常为5’-TTTV-3’），因此在处理多样化的目标序列时其应用受到一定限制。为了克服PAM对Cas12a激活效率和目标适应性的限制，我们尝试在RPA反应系统中实现可控的PAM引入。
结论
总结来说，我们开发了一种基于PAM工程化探针辅助的RPA–CRISPR/Cas12a（PEAR-CRISPR）平台，通过在RPA扩增过程中可控地引入PAM序列，克服了Cas12a激活对PAM的依赖性。与依赖引物工程来引入PAM的传统方法不同，该策略采用了合理设计的PAM引导探针结合Nfo介导的切割和延伸，从而保持了RPA的效率
未引用的参考文献
[21]、[22]、[23]、[24]
CRediT作者贡献声明
周宇：资源管理、项目协调、资金获取。严中强：数据分析。郝荣章：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金获取。吴毅：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据管理、概念构思。孔庆莉：数据分析。王梓轩：数据分析。聂友：数据分析。王忠忠：初稿撰写、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了北京市自然科学基金（编号L234051）、新发和重大传染病防控-国家重点科技项目（编号2025ZD01903403）以及北京市卫生健康委员会高层次公共卫生技术人才培养计划（编号2024-03-18）的支持。
吴毅目前是中国首都医科大学公共卫生学院的硕士研究生。她的研究致力于开发针对新发和再发传染病的快速检测技术。
