《Molecular Psychiatry》：Effects of SSRIs on the spatial transcriptome of dorsal raphe serotonin neurons
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5-羟色胺（serotonin）系统是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）治疗抑郁症的主要治疗靶点，然而SSRIs的作用机制仍未完全阐明。为研究SSRI给药对5-羟色胺神经元的分子和转录组效应，研究人员采用空间转录组学（一种在完整脑组织中实现空间分辨的R
5-羟色胺（serotonin）系统是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）治疗抑郁症的主要治疗靶点，然而SSRIs的作用机制仍未完全阐明。为研究SSRI给药对5-羟色胺神经元的分子和转录组效应，研究人员采用空间转录组学（一种在完整脑组织中实现空间分辨的RNA测序方法）进行分析。对包含中缝背核（dorsal raphe nucleus, DR）及相邻中脑结构的小鼠脑切片进行解析，揭示了六个具有独特分子特征和空间分布的5-羟色胺亚群。急性与慢性氟西汀（fluoxetine）处理均在DR中诱导了大量基因表达变化。值得注意的是，Htr1a表达在急性处理后升高，而在慢性给药后降低，这支持了先前关于5-羟色胺转运体阻断对5-HT1A自身受体（autoreceptors）效应的研究发现。基因富集和网络分析确定了SSRI给药调控的关键通路，包括Ras、MAPK和cAMP信号通路以及轴突导向相关通路。此外，研究人员观察到神经肽呈现处理依赖性、方向相反的转录变化，特别是促甲状腺激素释放激素（Trh）和前强啡肽（Pdyn），且在DR内具有不同的空间定位。总的来说，我们的转录组学和原位杂交分析揭示了SSRI在DR内作用的空间和细胞类型特异性异质性，为SSRI治疗效应的分子基础提供了新见解。
研究背景与目的
抑郁症是全球致残的主要因素之一，具有高终生患病率、高自杀风险和日益增长的发病率。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）是直接靶向大脑5-羟色胺系统的最常用处方治疗。尽管其在临床广泛应用，但SSRI给药在5-羟色胺神经元及其周围神经群体内引起的分子和转录组反应仍未完全阐明。理解SSRIs如何在精确的解剖学背景下，调控5-羟色胺神经元及其局部环路环境中的基因表达，对于阐明这些药物的细胞作用机制至关重要。
5-羟色胺系统表现出显著的分子和解剖学异质性。位于脑干中缝核的5-羟色胺神经元投射至全脑，调节从稳态调节到复杂情绪和动机状态等多种神经生理功能。中缝背核（DR）包含大多数前脑投射的5-羟色胺神经元，嵌入在复杂的神经环路中。先前研究基于电生理特性、投射模式和发育起源，已识别出5-羟色胺亚群间的分子和功能差异，但缺乏特异性分子标记限制了系统表征这些差异及其药理学反应的能力。单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究已开始揭示定义5-羟色胺亚型的独特分子特征，然而scRNA-seq本身缺乏空间背景，无法直接评估分子多样性如何与DR内的解剖学组织相关联。DR的细胞多样性还因存在其他神经元类型（如多巴胺能、谷氨酸能和GABA能神经元）以及各种神经肽表达细胞而进一步增强。因此，全面、无偏的空间基因表达图谱对于理解分子异质性如何在DR解剖结构中组织，以及空间上不同的神经元群体如何对药物干预产生差异反应至关重要。
SSRIs通过快速阻断5-羟色胺转运体（SERT）直接作用于5-羟色胺神经元，在数小时内提高细胞外5-羟色胺浓度，但其临床疗效需要数周的慢性给药。这种时间差异被认为涉及5-HT1A自身受体脱敏：初始的SSRI诱导的突触5-羟色胺升高激活这些自身受体，导致5-羟色胺神经元放电和释放减少。慢性SSRI治疗导致5-HT1A自身受体脱敏及随后的反馈抑制丧失，最终增加5-羟色胺神经元活性。尽管此模型在解释SSRIs延迟治疗起效方面具有影响力，但也提出了其他机制。抗抑郁药在包括前额叶皮层、海马和杏仁核在内的多个脑区诱导广泛的转录变化。然而，先前的研究主要局限于特定前脑区域的有限候选基因。最近的无偏转录组分析显示，慢性氟西汀在整个大脑中产生区域特异性效应，其中最显著的变化发生在DR。然而，其对5-羟色胺神经元、它们的空间亚型以及DR中其他细胞类型的具体影响尚不清楚。
为此，本论文发表在《Molecular Psychiatry》期刊，研究人员采用空间转录组学结合多重荧光原位杂交，全面绘制了小鼠DR的分子结构图，并表征了其对急性和慢性氟西汀给药的反应。旨在建立DR的空间分辨转录组图谱，识别定义不同5-羟色胺亚群及其解剖分布的分子标记，并揭示这些神经群体对急性与慢性SSRI治疗的动态转录反应，为理解SSRI在DR内作用的空间和分子异质性提供新见解，并对阐明抗抑郁作用的复杂机制具有启示意义。
关键研究方法
本研究采用成年C57BL/6J小鼠（8-12周龄，包含雄性和雌性）。通过灌胃给药，设置三个处理组：急性组（单次10 mg/kg氟西汀，1.5小时后取材）、慢性组（连续22天每日给药10 mg/kg，末次给药5小时后取材）和对照组（单次生理盐水）。使用Visium空间基因表达检测（10x Genomics）对包含DR的中脑冠状切片进行空间转录组学分析。通过Seurat软件进行数据处理、质量控制和聚类分析，识别DR及其亚群。差异基因表达分析使用Wilcoxon秩和检验。同时，采用多重RNAscope HiPlex对选定标记基因（Slc6a4、Htr1a、Vip、Pdyn、Trh、Bdnf、Slc17a8、Gad2）进行荧光原位杂交，在Leica DM6B显微镜（40倍油镜）上进行两轮成像，并使用Fiji、QuPath和StarDist进行图像处理和细胞分割分析。此外，利用CytoSPACE和SpaTalk等工具将已发表的DR单细胞RNA测序数据映射到空间转录组学点位上，进行细胞类型反卷积分析。功能富集分析使用DAVID进行KEGG通路和GO生物过程分析，蛋白互作网络通过STRING数据库构建并用Cytoscape可视化。
研究结果
空间转录组学分析揭示中脑和DR的空间分子域
通过无偏空间转录组学，研究人员分析了包含DR及邻近区域的成年小鼠冠状脑切片基因表达。在整个脑切片平均每个点位检测到3892个基因和10239条读长。基于基因表达进行共享最近邻聚类，揭示了13个不同的分子聚类。将这些分子聚类与脑组织中的空间位置对齐，在很大程度上重现了解剖学脑区，但也提供了同一脑区内更高分辨率的划分。空间测序清晰揭示了DR解剖学聚类，以及一个具有独特分子特征、双侧毗邻DR的聚类。无监督聚类定义了表达经典5-羟色胺标记的DR聚类，这些标记与5-羟色胺合成、再摄取、释放和调控相关，包括Tph2、Slc6a4、Slc18a2、Ddc和Gchfr。另一个分子聚类（侧DR-GABA）双侧毗邻DR，以Gad2表达为标记。空间转录组学方法可靠地基于5-羟色胺相关基因表达识别了DR。
DR 5-羟色胺系统内的空间亚群
空间转录组学分析揭示了DR内的6个不同分子亚簇，每个亚簇沿吻尾轴显示特定的解剖学分布。这些亚簇表现出独特的空间组织：一个中线、一个腹侧、一个尾侧、两个外侧亚簇和一个5-羟色胺标记表达较低的亚簇。解剖学5-羟色胺亚簇表现出由不同标记基因表达定义的强分子特性，而低5-羟色胺亚簇则以经典5-羟色胺标记的弱表达为特征。研究人员识别了亚簇特异性标记基因。为在单细胞分辨率上验证空间转录组学发现，研究人员对DR中的关键标记基因进行了多重原位杂交。中线亚簇由Slc17a8（编码囊泡谷氨酸转运体3，VGLUT3）的表达定义，约59.9%的Slc17a8神经元表达Slc6a4。GABA能标记基因Gad2在整个DR和邻近区域广泛表达，少数DR Gad2细胞共表达Slc6a4。5-羟色胺自身受体基因Htr1a与Slc6a4有广泛共表达。空间转录组学分析还识别了DR内具有不同空间分布的其他分子标记。Pdyn显示出强中线表达，并与5-羟色胺神经元大量共定位。Trh在DR的尾侧和腹外侧翼显示特定的表达模式，与5-羟色胺有中度重叠。Bdnf主要在外侧表达，与5-羟色胺共表达有限。Vip集中在沿导水管背侧的DR，与5-羟色胺重叠极少。研究人员将空间数据集与已发表的DR单细胞RNA测序数据集整合，通过CytoSPACE将五个已识别的分子5-羟色胺亚型（5-HT-I至V）映射到空间转录组学数据上。分析揭示了某些亚簇和亚群之间存在显著的空间重叠。亚型5-HT-V和尾侧空间簇表现出一致的表达谱。亚型5-HT-IV与中线空间簇一致。同样，亚型5-HT-I和外1空间簇显示出多个标记的共享表达。相比之下，亚群5-HT-II和III显示混合表达模式，包含中线和外侧群体的特征标记。定量空间分布分析揭示了偏好定位模式。虽然神经元在每个DR亚簇中占主导地位，但其他细胞类型（如星形胶质细胞和少突胶质细胞）在各亚簇中也不同程度存在。
急性和慢性SSRI处理对DR 5-羟色胺系统的影响
为研究SSRI给药对基因表达的影响，研究人员通过空间转录组学分析了氟西汀给药后DR的基因表达变化。鉴于SSRI给药与疗效之间存在时间差异，研究人员检查了急性和慢性处理条件。在DR内，急性和慢性SSRI给药导致差异表达基因富集于几个重要的信号通路和生物过程，包括Ras、MAPK、cAMP和轴突导向通路。慢性处理导致轴突导向基因的广泛下调，最显著的是Plxnc1。相反，慢性处理上调了Rasgrp1。5-羟色胺自身受体基因Htr1a显示双相调控，在急性处理后上调，随后在慢性给药后下调。神经元活动标志Fos在慢性处理中下调。从总共232个差异表达基因中，144个下调，98个上调。对照与慢性条件下下调差异表达基因数量最多，而急性与慢性条件下上调差异表达基因数量最多。每个处理比较都显示出大量独特的上调和下调差异表达基因。只有三个基因在所有三种处理条件下均显示差异表达：Pdyn、Esam和Nptx2。网络分析显示，急性SSRI处理后，Bdnf是检测到的唯一枢纽基因。慢性SSRI处理后，发现7个枢纽基因：Nras、Fos、Calb1、Rras、Fcer1g、Pdyn和Csf1r。比较急性与慢性SSRI处理时，发现10个枢纽基因。两个神经肽基因Pdyn和Trh在SSRI处理过程中表现出相反的动态调控。神经元活动模式分析揭示了DR亚区对SSRI处理的不同时间反应。慢性SSRI给药导致DR整体活动显著降低，这种活动降低特异定位于中线亚簇，而外侧亚簇保持基线活动水平。将差异表达基因映射到DR空间簇以及单细胞RNA测序衍生的5-羟色胺亚型时，发现差异表达基因在各空间簇中广泛表达，表明SSRI诱导的转录变化广泛发生在DR的解剖学范围内。许多核心SSRI响应转录程序在5-羟色胺亚型间共享，但单个基因的表达水平和细胞普遍性存在异质性。对KEGG通路和GO生物过程中差异表达基因的分布和方向性分析发现，信号通路在不同空间簇中代表性相对均匀，下调差异表达基因比上调更普遍。5-HT-V亚群通路参与最有限，而上调/下调混合模式在亚型5-HT-I至-IV中表现明显。个别差异表达基因分析揭示了非5-羟色胺调控的例子。例如，Bdnf在急性SSRI处理后显著上调，但单细胞RNA测序显示其在所有分析的亚型中表达低于10%阈值，原位杂交证实仅少数Bdnf表达细胞共表达Slc6a4，表明其上调主要发生在DR内的非5-羟色胺细胞中。
急性和慢性SSRI处理中DR神经肽的动态基因表达变化
转录组学分析揭示了SSRI处理期间Pdyn和Trh的反向调控。通过原位杂交证实，急性给药增加了中线DR中表达Pdyn的细胞数量和总PdynmRNA点，这种急性上调在慢性处理后部分逆转。慢性处理增加了外侧DR中表达Trh的细胞数量和总TrhmRNA点。Pdyn表达的SSRI诱导变化发生在5-羟色胺神经元中，而Trh调控似乎与其和5-羟色胺的共表达无关。此外，原位杂交证实了Pdyn和Trh在DR内的空间隔离。尽管在转录组学分析中被识别为差异表达基因，但原位杂交显示SSRI处理对DR中Htr1a、Bdnf或Vip表达无显著影响，尽管Bdnf呈现与转录组学发现一致的趋势。研究人员还调查了急性和慢性SSRI给药潜在的性别特异性效应，发现Pdyn和Trh的表达调控在雄性和雌性脑中是保守的。
讨论与结论
通过无偏空间转录组学，研究人员识别并绘制了DR中区域特异性标记。与先前的免疫组化和转录组学研究一致，检测到Slc17a8在中线5-羟色胺神经元富集，Pdyn在中线区域富集，Met在尾侧区域富集，Trh在侧DR富集。空间转录组学方法通过同时分析整个转录组，能够识别额外的标记，并评估这些空间分离的群体如何对SSRI处理产生差异反应。
比较急性和慢性处理条件揭示了广泛的转录变化。基因富集和网络分析确定了DR中232个差异表达基因的关键调控通路。慢性处理降低了包括Plxnc1在内的多个轴突导向基因的表达。通路水平分析显示，SSRI诱导的转录变化在DR空间簇和5-羟色胺亚型中广泛涉及主要信号级联，反应强度、方向性存在微小空间和分子异质性。枢纽基因和其他高度调控基因的变化与抗抑郁作用的神经营养假说一致。整合分析揭示了SSRI诱导的转录变化在DR中存在特定的空间和分子异质性。多数DR来源的差异表达基因在所有分子5-羟色胺亚型间共享，但也识别了亚型特异性调控，包括5-HT-III中的Pdyn和5-HT-I中的Trh。差异表达基因在5-羟色胺亚型和空间域中的表达模式异质性表明，SSRI作用可以差异性地涉及DR微环境内不同的5-羟色胺群体。
分析揭示了神经肽表达的重要变化，可能介导SSRI的直接行为效应。特别值得关注的是Pdyn的调控，其编码前强啡肽，一种激活κ阿片受体（KOR）的阿片肽。KOR激活产生镇痛作用，但也诱导烦躁和抑郁样行为。研究人员发现Pdyn的双相调控，在急性SSRI处理后表达增加，随后在慢性给药后减少。这种初始上调可能有助于SSRI治疗早期记录到的不良效应。神经肽编码基因Trh表现出与Pdyn相反的时间调控。慢性SSRI治疗上调侧DR中Trh表达，提示未来研究可探索此分子亚群的抗抑郁功能效应。
研究发现为先前关于SSRI治疗过程中5-HT1A受体适应的研究提供了补充。转录组数据显示Htr1a在急性处理后上调，慢性给药后下调。值得注意的是，活性分析揭示了空间异质性，慢性处理特异性地降低了中线DR亚簇的活动，表明自身受体介导的调控可能在5-羟色胺亚群间有所不同。这些转录变化与先前的电生理和免疫组化研究形成有趣对比，后者显示急性SSRI处理最初降低5-羟色胺神经元活动，在慢性治疗期间恢复到基线，并具有可变的区域依赖性效应。这种差异可能是由于空间转录组学数据代表了小型批量测量，可能捕获了分析区域内非5-羟色胺神经元的SSRI诱导变化。另外，不同的5-羟色胺亚型对SSRI处理的反应可能不同。
重要的是，Htr1a调控在整个大脑中表现出区域异质性，SSRI处理在DR与前脑靶区产生不同效应。虽然在DR中观察到下调与自身受体适应一致，但在海马和前额叶皮层的研究报告压力增加了Htr1a表达，而慢性氟西汀处理可减弱此效应。这些区域差异可能反映了5-HT1A受体在DR中作为抑制性自身受体，在前脑回路中作为前和突触后异质受体的不同功能作用。SSRIs延迟治疗效果可能源于跨多个脑区的协调适应。
Visium空间转录组学方法的一个限制是缺乏单细胞分辨率。为弥补此限制，研究人员采用了两步法。首先，对关键差异表达基因进行多重荧光原位杂交，实现了精确的细胞定位和单个神经元中转录本丰度的量化。其次，通过细胞类型反卷积分析，将空间数据与已发表的DR单细胞RNA测序参考数据集整合。该分析估计了不同细胞类型对每个点位表达谱的相对贡献。空间转录组学检测与某些差异表达基因的5-羟色胺共表达之间的不一致，例如Bdnf，说明空间转录组学捕获了整个组织微环境的综合反应，而单细胞方法和原位杂交验证提供了细胞类型分辨率。Bdnf主要在非5-羟色胺DR神经元中上调，这与抗抑郁作用的神经营养假说一致。识别Bdnf为网络枢纽基因表明，SSRI诱导的转录反应涉及DR内多种细胞类型的协调通信，而非仅限于5-羟色胺神经元内的孤立变化。
总之，本研究通过空间转录组学和原位杂交分析，揭示了SSRI在DR内作用的空间和细胞类型特异性异质性。研究识别了DR内具有独特空间分布的分子亚群，并阐明了急性和慢性氟西汀给药在这些群体中引起的动态转录变化。研究发现涉及关键信号通路（Ras、MAPK、cAMP、轴突导向）的广泛转录重塑，并揭示了神经肽Pdyn和Trh的相反、处理依赖性调控。这些结果为理解SSRI治疗效应的分子基础提供了新见解，对阐明抗抑郁作用的复杂机制具有重要意义。
