在C11-C12位置将吡啶与类固醇融合，以适应细胞色素P450 8B1的活性位点结构

《Steroids》：Synthesis of steroids fused with a pyridine at C11-C12 to accommodate the active site ceiling of cytochrome P450 8B1

　　

作者：Tu M. Ho、Elyse K. Frydendall、Jiaying Zhou、Samuel D. Offei、Hadi D. Arman、Emily E. Scott、Francis K. Yoshimoto

美国德克萨斯大学圣安东尼奥分校化学系，地址：One UTSA Circle, San Antonio, TX 78249

摘要

抑制细胞色素P450 8B1（CYP8B1）这一氧化甾醇12α-羟化酶是治疗肥胖、非酒精性脂肪肝病和糖尿病的一种策略。虽然含氮杂环化合物常作为P450抑制剂，但先前的研究表明，含有吡啶环的化合物由于其与血红素之间的距离（8.6 ?）过远而无法进入CYP8B1的活性位点。因此，在本研究中，我们通过将C12-酮类固醇中间体与丙炔胺在铜催化剂存在下进行缩合，将吡啶环连接到甾体的C11-C12位置。通过改变C3和C17位置的氧化状态（酮或醇），发现这些新的含有17-羟基的吡啶甾体类似物能够与CYP8B1的活性位点结合，但并未如预期那样与血红素铁发生配位。

引言

人类细胞色素P450 8B1（CYP8B1）是一种氧化甾醇12α-羟化酶，可将其底物中的C12α位置羟基化，生成12α-羟基氧化甾醇产物（图1A、1至2）[1]、[2]。缺乏编码P450 8B1基因的小鼠（Cyp8b1^-/-）在摄入高脂肪饮食时不易发胖[3]、[4]。此外，Cyp8b1敲除小鼠（Cyp8b1^-/-）也表现出对糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的抵抗能力[5]。最近对人类CYP8B1的研究表明，CYP8B1活性的丧失可提高胰岛素敏感性[6]。因此，抑制CYP8B1被认为是一种治疗肥胖[7]、糖尿病[8]和NASH[9]的方法。此前为合理设计CYP8B1抑制剂所做的努力中，合成了一种在C12位置含有吡啶环的甾体类似物[10]、[11]，预期该化合物能够像阿比特龙（abiraterone）与P450 17A1结合一样与CYP8B1的铁活性位点发生配位[12]。我们之前曾综述过甾体生成性P450酶抑制剂的相关研究[11]，而本研究正式描述了基于初步研究结果[10]、[13]合成的第二代CYP8B1抑制剂。最初假设C12位置的吡啶氮原子会与CYP8B1的铁活性位点形成路易斯碱-路易斯酸相互作用。然而，CYP8B1的首个晶体结构显示，由于存在色氨酸残基，该酶的活性位点上方只能容纳最大8.6 ?的空间[13]。当我们测量先前合成的甾体类似物中C6与吡啶杂环顶部的距离（图1C）[10]、[13]时，发现这一距离为9.1 ?，超过了CYP8B1活性位点的8.6 ?限制。因此，为了开发出更适合作为CYP8B1活性位点配体的化合物，我们设计了将吡啶连接到C11-C12位置的甾体，这样其尺寸更小，应该能够适应酶的活性位点（图1D）。

研究片段

17,17-(乙二氧基)-雄甾-5-烯-3β-O-叔-丁基二甲基硅醚（5b）的合成

将二醇5a（12.0?g，34.4?mmol，1.0当量）溶解在吡啶（150?mL）中，室温下加入TBSCl（10.4?g，68.8?mmol，2.0当量）和咪唑（9.4?g，137.7?mmol，4当量）。通过TLC监测反应直至完成，随后加入H₂O（150?mL）。混合物用EtOAc（3?次，每次100?mL）萃取。合并的有机层用H₂O（400?mL）和盐水（200?mL）洗涤，减压浓缩后通过柱层析（硅胶，100%）纯化。

含有C11-C12连接吡啶的甾体的合成始于二醇5a（方案1），该化合物是由先前研究中回收的12β-羟基脱氢表雄酮经Sch?necker氧化后得到的[10]、[20]。具体步骤为：首先使用TBS氯化物和咪唑将脱氢表雄酮-3-O-叔-丁基二甲基硅醚（DHEA-3OTBS醚）的17-亚氨基吡啶衍生物进行保护。

为了验证化合物的尺寸，我们测定了其晶体结构。成功获得了7的晶体，因此展示了该结构（图2）。新合成的含吡啶甾体类似物（化合物7，本报告）与之前合成的C12-吡啶甾体类似物（化合物11，之前的报告）在图3A和3B中进行了对比。两种晶体结构的叠加显示，从C6到吡啶杂环顶部的距离存在明显差异。

Tu M. Ho：负责撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、数据可视化、方法学设计、实验研究及数据整理。Elyse K. Frydendall：方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Jiaying Zhou：数据验证、方法学设计、实验研究、数据分析。Samuel D. Offei：撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、方法学设计、实验研究。Hadi D. Arman：撰写、审稿与编辑、原始稿件的撰写、数据可视化。

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

本研究得到了Max and Minnie Tomerlin Voelcker基金（FKY, TMH, SDO, HA）以及NIH R37 GM076343（EES, EKF, JZ）的支持。Francis K. Yoshimoto博士获得了Max and Minnie Tomerlin Voelcker基金颁发的Voelcker基金青年研究员奖。