利用生物发光技术对移植的人类肠道类器官进行无创的体内监测

《Surgery Open Science》：Non-invasive in vivo monitoring of transplanted human intestinal organoids using bioluminescence

　　**作者列表：**
Chioma Moneme | Antonio Vinicios Alves da Silva | Prisca C. Obidike | Bryan A. Hogg | Georgia B. Brousseau | Casandra Robinson | Christian Roig-Laboy | José Kleybson de Sousa | Yuwen Zhang | Lily S. Cheng | Sean R. Moore

**研究机构：**
美国弗吉尼亚大学外科系儿科外科分部，夏洛茨维尔，弗吉尼亚州

**摘要：**
背景：
将多能干细胞衍生的类人肠道器官（HIOs）异种移植到动物宿主体内，用于模拟早期人类小肠发育过程。然而，传统的评估HIOs植入和扩增的方法涉及侵入性操作，且这些操作会导致动物死亡。我们开发了一种新型HIO平台，该平台能够使肠道上皮稳定表达红移荧光素酶，从而实现HIOs的敏感、纵向体内追踪。

**方法：**
使用慢病毒将人类胚胎干细胞（hESC）系H9转导含有红移荧光素酶的质粒，该荧光素酶受泛素C启动子调控。经过阳性筛选后，细胞被分化为内胚层和中/后肠球状结构（HIOs）。在将HIOs移植到10只免疫缺陷SCID小鼠的肾包膜下之前，通过免疫荧光技术确认了HIOs的成熟情况及荧光素酶的表达。我们进行了为期12周的连续体内生物发光成像，并使用Kruskal-Wallis检验比较了不同时间点的发光强度。实验结束后，切除HIOs以评估其大小和组织结构。

**结果：**
稳定的转导过程未损害hESC的基因组完整性、多能性或其分化为HIOs的能力。在10只小鼠中有9只，移植后两周内即可检测到HIOs的发光信号。平均发光强度随时间显著增加（p = 0.03）。生物发光强度与切除后的HIOs质量呈正相关（ρ = 0.923，p < 0.001）。有趣的是，荧光素酶在hESC中的表达是均匀的，但在移植前后HIOs中仅限于上皮细胞。

**结论：**
我们成功从多能干细胞中生成了可移植的生物发光HIOs，为动态监测HIOs提供了基础，有助于进一步阐明人类肠道发育过程及损伤反应机制，并为其他应用奠定基础。

**引言：**
胃肠道（GI）是一个高度特化的器官系统，负责消化、营养吸收、免疫防御、屏障维持以及与肠道微生物群的共生互动[1]。这种功能复杂性，加上持续暴露于饮食和微生物抗原，使得研究肠道稳态和疾病发病机制变得极具挑战性。能够准确再现人类肠道细胞结构、生理功能和动态信号传导的可靠实验模型对于推进机制理解和转化医学研究至关重要。
过去十年中，类器官技术的进步推动了GI研究的发展，使得可以从多能干细胞或原代组织中生成类人肠道器官（HIOs）[2][3]。由人类多能干细胞（hPSCs）衍生的HIOs能够自组织成三维结构，模拟关键的上皮和间充质成分[2][3][4]。尽管体外培养的HIOs在组织复杂性上有所局限（如缺乏明确的隐窝-绒毛结构），但在免疫缺陷小鼠的肾包膜下异种移植后，HIOs会展现出更高的细胞和组织复杂性，形成具有平滑肌层，并发展出包含肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞的隐窝-绒毛结构[5][6]。功能上，这些在肾包膜下成熟的HIOs具备与天然肠道相当的吸收营养、分泌黏液和屏障保护能力[7]。
除了在发育模型研究中的应用外，HIOs在再生医学、疾病建模、药物发现以及宿主-微生物相互作用研究中也具有巨大潜力[8][9][10]。然而，传统的评估HIOs植入、生长和治疗反应的方法通常需要侵入性手术，这限制了在同一动物体内进行长期观察的能力。
为克服这一限制，先前采用了荧光探针进行体内追踪，实现了无需侵入性操作的实时监测[11][12][13]。但目前这些方法依赖外部光源激发荧光信号，要求光源强度足够高以穿透周围组织[14]。荧光信号需要穿过组织到达外部检测器，但可能受到组织散射的影响，从而降低有效穿透深度。此外，荧光背景噪声较高也会影响成像效果。
相比之下，生物发光成像（BLI）是一种非侵入性的实时监测方法，无需外部照明，其荧光信号由荧光素酶-荧光素反应产生，可高灵敏度量化[15]。这种方法允许随时间重复测量，背景干扰较小。由于不受外部照明影响，BLI具有更好的组织穿透能力，已在癌症生物学、基因治疗和传染病研究中得到广泛应用[16][17]。然而，BLI在HIOs异种移植中的应用仍受到技术限制，主要原因是活体组织会强烈吸收或散射可见光谱范围内的荧光[19][20]。红移荧光素酶变体能够发射更长波长的光，从而部分克服了这一限制[15]。
在本研究中，我们改造了人类胚胎干细胞（hESC）系，使其在泛素C（UbC）启动子下稳定表达红移荧光素酶，从而在分化为HIOs后实现稳定的上皮特异性生物发光标记。我们利用该系统在免疫缺陷小鼠的肾包膜移植后，纵向监测HIOs的植入、生长和细胞器特异性表达。据我们所知，这是首次基于BLI的非侵入性体内追踪移植HIOs的实例。这些发现为动态监测肠道组织发育和存活提供了新方法，对肠道再生和疾病研究的临床前研究具有广泛意义。

**具体方法：**
1. **建立稳定的生物发光报告基因hESC系：**
由CCHMC的多能干细胞设施使用IVISbrite?慢病毒颗粒（Revvity，#CLS960002）将hESC系H9改造为稳定表达生物发光报告基因的细胞系。该病毒颗粒携带受UbC启动子调控的Luciola italica荧光素酶基因。受体hESC细胞系H9（WiCell，#WA09）在mTeSR1?完全培养基（Stemcell Technologies，#85850）中培养，添加4 μg/mL六甲嘧啶溴化物，感染复数（MOI）为0和1，培养24小时。
2. **选择和扩增克隆：**
通过筛选，选择多个嘌呤霉素抗性克隆进行进一步培养。最终选择一个稳定的克隆（H9:RLuc）用于后续实验，并在嘌呤霉素2 μg/mL（InvivoGen，#ant-pr-1）培养基中扩增。通过检测Nanog、Sox2和Oct-3/4等未分化标志物的表达确认其多能性，并通过诱导肠道分化进一步验证其多能性[21]。
3. **核型分析：**
使用经典的G-带技术对H9:RLuc克隆进行核型分析[22]。细胞在预先涂有hESC合格Matrigel?（Corning，#354277）的6孔板中培养，直至细胞密度达到约80%。用colcemid处理使细胞进入中期，然后用0.075 M KCl溶液裂解细胞。细胞固定在甲醇：醋酸溶液中，滴加到玻璃载玻片上，用Giemsa染色，观察典型的暗带和亮带图案。
4. **实时生物发光监测：**
使用KronosDio AB-2550发光计（Atto，日本）确认荧光报告系统的功能。将H9:RLuc细胞以三种不同的接种密度（初始细胞悬液的1倍、1:4倍和1:8倍稀释）接种在35 mm Matrigel涂层的培养皿中。将不含报告基因的亲本H9细胞作为阴性对照。所有培养物在添加200 μM D-Luciferin的mTeSR-1完全培养基中维持。连续六天监测生物发光情况。
5. **H9:RLuc的分化：**
按照先前发表的方法将H9:RLuc细胞分化为类人肠道器官（HIOs）[22]。首先在RPMI 1640培养基中添加100 ng/mL Activin A和20 ng/mL rhWnt3a诱导内胚层分化，再继续培养48小时，添加100 ng/mL Activin A、8 ng/mL rhFGF2和0.2%胎牛血清。第三天通过免疫荧光染色检测SOX17和FOXA2的表达情况。
6. **HIOs的进一步培养：**
将细胞诱导为中/后肠阶段，使用含有500 ng/mL rhWnt3a和500 ng/mL rhFGF4的培养基处理4天。收集形成的中/后肠球状结构，接种在生长因子减少的Matrigel培养基中，并在Sato隐窝培养基中维持。
7. **肾包膜移植：**
使用10只成年NOD-SCID小鼠（NSG）进行实验。这些小鼠来自Jackson Labs（品系：005557），包括5只雄性和5只雌性。所有小鼠均饲养在无病原体的动物设施中（弗吉尼亚大学医学中心或辛辛那提儿童医院医学中心）。操作过程符合NIH实验室动物护理和使用指南。所有涉及动物的实验均获得弗吉尼亚大学（批准号4150）和辛辛那提儿童医院（批准号IACUC2024–0112）的机构动物护理和使用委员会批准。
8. **体内生物发光成像：**
使用LagoX系统（Spectral Instruments Imaging，图森，亚利桑那州）进行体内生物发光成像，配备背照式冷却CCD相机。麻醉小鼠后，腹腔注射30 mg/kg D-luciferin。将动物置于成像平台上，每2分钟拍摄一次图像，直至生物发光达到峰值。
9. **活细胞成像：**
使用Ti2 Spectra显微镜（尼康，日本）对H9:RLuc细胞、中/后肠球状结构和HIOs进行活细胞成像。细胞培养基中添加D-luciferin至最终浓度200 nM。
10. **免疫荧光染色：**
对H9:RLuc细胞进行免疫荧光分析，先在室温下用4%甲醛固定30分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，再用0.5% Triton X-100渗透30分钟。接着用0.5% Triton X-100和5%正常驴血清封闭45分钟。按补充方法中的稀释比例加入一抗，4°C下孵育过夜，再用PBS洗涤三次，最后加入二抗孵育1小时。核用DAPI染色。荧光图像是使用Ti2 Spectra显微镜（尼康，日本）获得的。一抗和二抗的详细信息及稀释比例见补充材料（表S1）。免疫组化（IHC）是在4微米的FFPE组织切片上进行的。切片首先用二甲苯脱蜡，然后通过一系列乙醇进行重新水化。抗原修复使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）在高压锅中进行15分钟。内源性过氧化物酶活性用H2O2阻断，非特异性结合位点在孵育一抗之前用封闭血清阻断。切片随后与小鼠抗Chromogranin A（罗氏诊断公司，目录号LK2H10）或Anti-Villin抗体[SP145]（Abcam公司，编号ab130751）孵育，接着是适当的HRP偶联的二抗，最后进行显色检测。切片用苏木精复染，脱水后装片以供显微镜评估。

体外组织处理与分析：在不同时间点对小鼠实施安乐死，以评估植入后长达12周内HIO大小的变化。安乐死后，取出含有HIO的左肾并称重。HIO的质量通过从同龄同大小的左肾总质量中减去HIO的质量来估算。使用ImageJ 1×版本1.54中的追踪工具测量HIO的横截面积[24]。取出的HIO用4%甲醛（PFA）固定，然后包埋在石蜡中。根据先前发表的协议[23]、[25]，将组织切成4微米厚的切片，装片在玻璃载玻片上，脱蜡，并逐步用乙醇和磷酸盐缓冲盐水重新水化，为免疫组化分析做准备。对于免疫组化，切片先用5%驴血清封闭30分钟，然后在4°C下过夜孵育一抗。接下来，切片在室温下用含有二抗的封闭缓冲液孵育2小时。成像使用Ti2 Spectra显微镜（尼康，日本）完成。

数据与统计分析：由于数据非高斯分布，因此采用了非参数方法。使用Spearman等级相关系数（ρ）评估以下关联：(i) 生物发光信号强度与细胞数量，(ii) 细胞活力与细胞数量，以及 (iii) 生物发光信号强度与HIO数量和移植HIO质量。在多个时间点测量的辐射度使用Kruskal–Wallis检验进行比较，随后使用Dunn的事后成对比较。使用Spearman等级相关系数评估移植HIO生物量（mg）与体内辐射度之间的关系。为了描述明显的指数关系，拟合了一个对数线性回归模型，并对辐射度进行log10变换以满足线性假设。拟合模型为：log10radiance=β0+β1×HIO?biomass+?。模型参数（β?, β?）通过普通最小二乘法估计。数据以移植HIO生物量为x轴，体内辐射度为log10变换后的y轴绘制。绘制了带有95%置信带的拟合回归线。所有分析均在R（v4.5）中进行，可视化使用ggplot2。所有检验均为双侧检验，P≤0.05被认为具有统计学意义。

结果：稳定的生物发光hESC系保持多能性并持续发出信号
一个编码红移荧光素酶报告基因的质粒稳定整合到H9人类胚胎干细胞（hESCs）的基因组中，生成了一个生物发光细胞系（H9:RLuc）。这种修饰没有改变核型，因为G带分析（约400–800条带分辨率）未检测到异常，也没有影响多能性，细胞通过免疫荧光确认仍表达Nanog、Oct3/4和Sox2（补充图1S）。未分化的H9:RLuc细胞在D-荧光素存在下表现出强烈的生物发光（图1A），荧光素酶表达通过免疫荧光得到证实（图1B）。为了评估长期稳定性，细胞在持续供应荧光素的培养箱（KronosDio）中培养。生物发光在几天内保持稳定，没有光漂白现象，并且信号在昼夜周期中保持恒定，表明对昼夜节律波动不敏感。生物发光信号强度与活细胞生物量成正比，这一点通过标准光学曲线验证，该曲线将光子计数与细胞数量相关联（Spearman ρ = 0.913，p < 0.001；图1C和D）。

下载：下载高分辨率图像（929KB）
下载：下载全尺寸图像

图1. HESCs中稳定生物发光报告基因的验证
(A) H9:RLuc细胞的免疫荧光染色显示细胞质中的荧光素酶表达（红色）和DAPI核染色（蓝色）（上图）。下图：活细胞生物发光成像叠加在明场图像上。刻度尺，200 μm。
(B) 在高、中和低密度下培养的H9:RLuc细胞的实时生物发光监测，显示信号随时间稳定输出。
(C) 标准曲线显示生物发光强度与细胞数量的相关性。图中显示了一个24孔板中光子计数的代表性伪彩色图像。
(D) 双轴分析生物发光信号（橙色）和细胞活力（resazurin还原；蓝色）与细胞数量的关系。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

生物发光强度与体外人类肠道类器官生物量相关
报告基因信号在分化为成熟的人类肠道类器官（HIOs）的过程中持续存在，这些类器官在暴露于D-荧光素后发出生物发光（图2A）。发光强度与每个孔中的HIO数量成线性关系（Spearman ρ = 0.96，p < 2.2 × 10^-16；图2B），表明BLI可以作为培养中总HIO生物量的定量替代指标。

下载：下载高分辨率图像（471KB）
下载：下载全尺寸图像

图2. 体外生物发光强度与人类肠道类器官（HIO）生物量相关。
(A) 来自H9:RLuc细胞的成熟HIOs的代表性复合图像。明场图像叠加了伪彩色的生物发光信号。刻度尺表示辐射强度。
(B) 散点图分析显示总生物发光与每个孔中HIO数量的相关性。橙色线代表带有95%置信区间的线性回归拟合（阴影区域）。Spearman等级相关系数（ρ）和p值已标出。

分化后报告基因表达限制在肠道上皮层
在未分化的hESCs中，荧光素酶表达均匀，并在整个中肠和后肠球状体阶段持续存在（图3A）。然而，在最终分化为HIOs时，生物发光仅限于上皮层，在周围的中胚层中检测不到信号（图3B）。这种偶然的分区表达在多个独立的分化批次中一致，并通过组织学分析得到证实（图5C）。

下载：下载高分辨率图像（940KB）
下载：下载全尺寸图像

图3. HIO成熟过程中荧光素酶活性限制在上皮层。
(A) 中/后肠球状体中的均匀生物发光。
(B) 在成熟的HIOs中，荧光素酶信号仅限于肠道上皮层，在周围的中胚层中没有活性。图像是在添加D-荧光素后10分钟获得的；信号用伪红色表示。刻度尺，100 μm。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

生物发光能够无创追踪体内HIO的植入和生长
表达肠道上皮标记物的HIOs被移植到免疫缺陷小鼠（n = 10）的左肾囊下，所有动物都存活了下来。移植后两周，9/10的小鼠在移植部位检测到生物发光，移植分析确认这些动物体内存在HIOs。纵向生物发光成像显示平均辐射度（光子s^-1 cm^-2 sr^-1）逐渐增加。由于辐射度值分布非正态，数据以每个时间点的中位数（IQR）表示。第2周（n = 9）时，中位数辐射度为74,300（34,700–92,400）。第5周时，中位数增加到257,665.36（89,000-518,000）。到第12周时，值达到1,800,000（1,450,000–2,047,500）（图4A–B）。相应地，HIO的横截面积从5周的10.13 ± 3.8 mm^2增加到12周的39.78 ± 9.5 mm^2（n = 6，p = 0.02）（图5A，B），平均质量从0.14 ± 0.09 g增加到0.26 ± 0.09 g（图4C）。生物发光信号强度与移植HIO的重量呈正相关（Spearman ρ = 0.929，p < 0.001）。

下载：下载高分辨率图像（266KB）
下载：下载全尺寸图像

图4. 生物发光成像能够纵向追踪移植的HIOs。
(A) 移植后2周和12周的免疫缺陷小鼠的代表性BLI图像。图像是在腹腔内注射D-荧光素后13–20分钟获得的。颜色刻度表示生物发光强度。
(B) 移植部位的生物发光信号纵向量化（在10只动物中有9只可检测到）。箱线图显示中位数（红色菱形）、四分位数范围（箱子）和1.5 × IQR（须状部分），单个数据点用橙色表示。星号表示统计显著性（通过Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后多重比较程序，p = 0.05）。

(C) 对数10变换后的辐射度与HIO生物量的线性回归分析（R2 = 0.811，p < 0.001）。Spearman等级相关系数（ρ = 0.929，p < 0.001）确认了显著的正相关关系。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网络版本。）

下载：下载高分辨率图像（962KB）
下载：下载全尺寸图像

图5. 移植的人类肠道类器官（HIOs）的组织学特征。
(A,B) 移植后5周（A）和12周（B）的小鼠肾脏的宏观图像；箭头指示植入肾囊下的HIOs。刻度尺：2 mm。
(C) 12周移植的HIOs的苏木精和伊红（H&E）染色。刻度尺：50 μm。
(D) 乳糖酶的免疫荧光染色显示移植HIOs中潘氏细胞的存在。刻度尺：50 μm。
(E) 荧光素（LUC）的免疫荧光染色显示移植HIOs中的上皮限制性报告基因表达。刻度尺：50 μm。
(F) Muc2的免疫荧光染色显示移植HIOs中的杯状细胞分化。刻度尺：50 μm。
(G) 蔗糖酶-异麦芽糖酶（SI）的免疫荧光染色显示成熟的肠细胞分化。刻度尺：50 μm。
(H) 色蛋白A（CHGA）的免疫组化染色显示肠内分泌细胞分化。刻度尺：50 μm。
(I) 维林（VIL1）的免疫组化染色显示吸收谱系的存在。刻度尺：50 μm。

对数10变换后的辐射度的线性回归分析显示体内生物发光信号强度与HIO生物量之间存在显著的指数关系（R2 = 0.811，p < 0.001）。该模型具有很高的解释能力，生物量解释了辐射度方差的81.1%。估计的斜率（β1 = 0.00404，95% CI：0.00229至0.00578）表明，HIO生物量每增加1 mg，体内辐射度大约增加0.93%。因此，可以使用逆函数从体内辐射度值估算HIO生物量。

生物发光报告基因表达不影响体内HIO的成熟
对移植HIOs的组织学分析显示其分化为肠道组织，其宏观结构和复杂性与先前发表的描述相似[5]。成熟过程与荧光素酶表达同时发生（图5E）。通过苏木精和伊红（H&E）染色对移植HIOs进行组织学分析，显示其具有由结缔组织、类似平滑肌的层和明显的绒毛状结构组成的良好组织结构（图5C）。免疫组化和免疫荧光显示存在多种专门的成熟上皮细胞类型，包括吸收谱系，如蔗糖酶-异麦芽糖酶+肠细胞和Villin1+吸收细胞（图5G，I）。免疫荧光确认的乳糖酶的存在表明存在分泌谱系，包括潘氏细胞（图5D）；肠内分泌细胞，表达色蛋白A（图5H）和Muc2+杯状细胞（图5F）。这些发现证实移植的HIOs可以在体内存活、生长和成熟，同时保持生物发光。

讨论
本研究首次证明，生物发光成像（BLI）可以作为一种无创的、纵向的方法，用于评估移植的人类肠道类器官（HIOs）在体内的植入、存活和生长。我们展示了BLI可以在移植后两周内确认成功的植入，并跟踪长达十二周的HIO生长。在体外和体内观察到的持续稳定的光发射突显了生物发光相对于荧光报告基因系统的优势，后者容易发生光漂白并且在持续激发下表达稳定性降低[26]。Jung等人报道了使用荧光标记的HIOs进行肠道类器官的移植，但观察到组织穿透有限和背景较高。Bergenheim等人使用共聚焦激光内镜和荧光染料标记HIOs，发现信号持续时间短且难以到达深层结构[12]。与这些早期报告相比，我们的BLI方法提供了稳健的、纵向的、无创的跟踪，并且背景最小，反映了生物发光技术的重大进步。这消除了对潜在光毒性照明的需求，并能够检测到更深的组织信号，这对于转化应用非常重要。

在HIO异种移植研究中，一个持续的挑战是在不等待几周或牺牲实验动物的情况下确认成功的植入[23]、[25]。在这里，使用红移荧光素酶报告基因克服了这一限制，允许早期检测和连续监测，而无需侵入性程序。尽管我们的实验使用肾囊作为移植部位，但红移生物发光光的穿透性表明这种方法可以很容易地适应其他位置，例如肠系膜，因为在这些位置光通过组织的衰减可能对其他方法构成更大挑战。反复麻醉和成像可能会损害小鼠的福利并引起一定程度的生理应激反应，这可能会混淆实验结果[27]、[28]、[29]、[30]。应激诱导的免疫抑制已知会影响肿瘤异种移植[27]、[29]，然而对于非肿瘤性异种移植（如人类肠道类器官（HIOs）尚未有类似的研究结果。此外，我们没有发现证据表明荧光素的使用会引发可测量的生理应激或干扰类器官或其他异种移植的生长。综合这些观察结果，支持使用生物发光成像技术对HIOs进行长期监测，表明该过程本身不太可能引入显著的实验偏差。巧合的是，尽管在未分化的hESC状态下荧光素表达普遍存在，但在分化为HIOs后，荧光素表达仅限于上皮细胞层。我们选择了UbC作为启动子，因为它通常被用作“组成型”启动子；然而，没有一种启动子在所有细胞类型和分化状态下都表现出一致的活性[31]。考虑到慢病毒整合的半随机性，这种谱系特异性限制可能源于整合到了一个受到间充质特异性异染色影响的基因组区域。这一解释与相关报告一致，即UbC在人类胃肠道中广泛表达，但在富含上皮组织的区域（包括胃和小肠）表达更高[32]、[33]。然而，我们也意识到缺乏平行分化的未修饰亲本对照系，这限制了我们排除潜在克隆伪影或修饰相关效应的能力。这种细胞层隔离可能解释了体内生物发光强度（BLI）与HIO移植块总质量之间的相关性相对较弱的原因。BLI信号可以作为上皮生物量的代理指标，而总体测量则包含了间充质和分泌成分[34]。未来通过直接量化上皮生物量或使用其他启动子的研究可能会加强BLI信号与组织质量之间的预测关系。此外，对于需要在特定组织层中表达的应用，可以使用靶向基因编辑工具（如CRISPR-Cas9）来实现更精确的整合。

上皮细胞特异性报告基因的表达在体外和体内研究肠道上皮细胞（IEC）的稳态方面具有多个潜在优势；例如，在体外HIO环境中筛选对IEC具有特异性反应的化合物；以及追踪HIO来源的IECs在体内受损肠道上皮中的植入情况。分化后生物发光报告基因的细胞层隔离证明了这种方法适用于研究异种移植HIOs中的细胞类型特异性动态。通过将谱系或细胞类型特异性启动子与生物发光报告基因结合，这种策略可以实现体内定义细胞群体的实时、无创监测，这对许多疾病病理学研究具有临床意义。值得注意的是，这种生物发光多能hESC系能够分化为HIOs并再现天然肠道的结构复杂性，包括分泌和吸收细胞谱系，表明这种工程策略保留了发育潜力。然而，目前的局限性在于缺乏关于吸收、分泌和酶活性的功能验证。未来的研究必须证明HIOs能够再现这些生理过程，以确立其在再生疗法中的实用性。

总结来说，我们开发了一种稳定的多能hESC系，该系表达一种红移荧光素报告基因，支持高效的体外分化为HIOs，并能够实现体内植入和生长的实时、无创监测。这种方法通过提供一种敏感、可重复且可适应的工具，填补了异种移植研究中的一个关键空白，用于实时评估人类肠道组织植入物。能够长期且无创地追踪移植组织对于研究类器官生物学机制以及推进疾病模型和再生疗法的发展具有重要意义。

**作者贡献声明：**
Chioma Moneme：撰写——初稿、研究、概念化。
Antonio Vinicios Alves da Silva：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。
Prisca C. Obidike：撰写——初稿、研究、数据分析。
Bryan A. Hogg：研究、数据分析。
Georgia B. Brousseau：研究。
Casandra Robinson：项目管理、资金获取、概念化。
Christian Roig-Laboy：研究。
José Kleybson de Sousa：研究。
Yuwen Zhang：研究。
Lily S. Cheng：撰写——初稿、监督、方法学、研究、数据分析。
Sean R. Moore：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。

**关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明：**
在准备这项工作时，作者使用了GPT 4来改进语言和可读性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

**资金/支持：**
本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（INV-039470）的支持。
CM和PO得到了NIH/NHLBI T32培训资助（T32HL007849）的支持。
LC得到了NIH/NIDDK K08DK133673的支持。