《npj Aging》：Social isolation of aged mice drives dramatic release of inflammatory lipoxygenase-derived oxylipins
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氧化脂质（oxylipins）是来源于多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）的信号分子，是调控炎症过程的关键介质。衰老加剧了这一网络的紊乱，促进了炎症老化（inflammageing）。社会隔离是衰老过程中的常见现
氧化脂质（oxylipins）是来源于多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）的信号分子，是调控炎症过程的关键介质。衰老加剧了这一网络的紊乱，促进了炎症老化（inflammageing）。社会隔离是衰老过程中的常见现象，可能促进促炎反应的出现，进一步加剧认知衰退和衰弱等状况。本研究探讨了重复性社会隔离对老年小鼠七个不同器官（脑、心脏、脂肪、肝脏、肺、肌肉、脾脏）和血清中炎症相关氧化脂质谱的影响。此外，研究人员探索了体育锻炼作为缓解衰老和隔离相关炎症的工具。研究结果表明，社会隔离导致白细胞介素-1β（IL-1β）水平显著升高，并刺激脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）衍生的氧化脂质以器官依赖性的方式显著产生，尤其在肝脏、肺和脾脏中最为明显。体育锻炼未能减轻社会隔离诱导的促炎效应。这些效应并未在循环系统中发生，因为血清氧化脂质水平在隔离后保持相对不变。器官中氧化脂质意外且显著的升高凸显了社会隔离的有害影响，并提示氧化脂质在应激相关的炎症老化中起关键作用。
研究背景与问题
衰老是一个复杂的、多因素的生物与社会过程，伴随有害变化的积累，常导致健康水平下降、认知衰退以及整体功能与适应性的丧失。稳态的破坏，由免疫功能受损、免疫衰老（immunosenescence）以及随后的慢性低度炎症（称为炎症老化，inflammageing）增加所引起，被认为是衰老的潜在标志之一。炎症过程受到细胞因子、趋化因子和氧化脂质等介质网络的紧密调控。在衰老过程中，这一复杂网络变得失调，并加剧炎症过程。氧化脂质来源于多不不饱和脂肪酸（PUFA），包括omega-6（如花生四烯酸，arachidonic acid, AA, C20:4）和omega-3（如二十二碳六烯酸，docosahexaenoic acid, DHA, C22:6；二十碳五烯酸，eicosapentaenoic acid, EPA, C20:5）。它们的作用模式既有促炎性也有抗炎性：促炎的AA衍生的前列腺素（prostaglandins, PG）和白三烯（leukotrienes, LT）通过环氧合酶（cyclooxygenase, COX）和5-脂氧合酶（5-lipoxygenase, 5-LOX）途径生物合成，而抗炎和促消退的氧化脂质主要来源于omega-3-PUFA，由5-、12-和15-LOX生成。后一类氧化脂质包括专门的促消退介质（specialized pro-resolving mediators, SPM），如保护素（protectins）、脂氧素（lipoxins, LX）、maresins（MaR）、消退素（resolvins, Rv）及其单羟基化前体（如15-羟基二十碳五烯酸，15-HEPE；17-羟基二十二碳六烯酸，17-HDHA）。异常的氧化脂质生物合成是几种年龄相关疾病的特征，如心血管疾病、动脉粥样硬化和神经退行性疾病。生活方式，特别是社会隔离和孤独，与不良健康结果、炎症增加和衰老过程中的认知衰退直接相关。社会隔离在小鼠研究中显示出可的酮（corticosterone）水平升高（小鼠的主要活性内源性糖皮质激素），表明存在生理应激反应，同时伴有炎症增加以及认知和免疫功能受损。相反，积极的社会环境与更好的免疫力和更长的寿命相关。然而，社会隔离如何影响氧化脂质网络以及氧化脂质在社会隔离的生理后果中扮演何种角色尚不清楚。代谢干预措施，如自愿运动（例如，人类散步，小鼠自愿跑轮运行），被认为是一种可以延长个体寿命和健康寿命的工具，并可能减轻隔离等其他生活方式因素的负面影响。虽然运动带来多种积极结果，但这些益处背后的确切分子驱动因素尚未完全了解。本研究旨在阐明年龄相关的社会隔离及其相关应激对老年小鼠炎症微环境的影响，重点关注氧化脂质和认知功能，并探讨伴随的运动（即自愿跑轮运行）是否能减轻社会隔离的有害影响。
研究方法概要
研究使用雄性C57BL6/J/UKJ小鼠，分为成年（5月龄）和老年（20月龄）组。为探究晚年社会隔离应激的影响，研究人员对18月龄小鼠进行为期8周、每周3个单独夜晚的重复性单笼隔离。此外，研究人员将运动作为一种已确立的抗炎代谢干预手段，为部分隔离的老年小鼠提供了跑轮。实验结束时收集了7个器官（脑、心脏、脂肪、肝脏、肺、肌肉、脾脏）和血清样本。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对器官匀浆中的炎症相关细胞因子（如IL-1β, IL-1ra, IL-6, IL-12 p70, TNF-α）进行定量。通过基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的靶向脂质组学方法评估了各器官的氧化脂质特征谱。通过Barnes迷宫测试评估了隔离老年小鼠的空间学习、短期和长期记忆以及认知灵活性。血清样本通过商业化的蛋白质组分析试剂盒（Proteome Profiler）分析了111种炎症相关细胞因子、趋化因子等的相对丰度。数据分析使用GraphPad Prism、RStudio等软件，统计方法包括单因素方差分析（ANOVA）和Student’s t检验等。
研究结果
1. 器官特异性炎症细胞因子受衰老影响各异，但可被重复性社会隔离显著诱导
衰老显著增加了小鼠的体重。在评估的促炎细胞因子中，IL-1β水平在衰老过程中表现出器官特异性变化：在脑、心脏和肝脏中显著降低，仅在肺中显著升高。其他促炎细胞因子（IL-6, IL-12 p70, TNF-α）水平大多保持不变或随衰老显著降低。然而，当老年小鼠经历社会隔离（O-ISO）时，IL-1β在所有研究的器官中（除脾脏外）均显著增加。其他促炎细胞因子在隔离后也显示出类似的动态，在脂肪、心脏、肝脏和肌肉匀浆中观察到水平强烈增加。IL-1ra的水平在隔离后的老年小鼠的脂肪、心脏、肝脏、肌肉和脾脏中也显著增加。这表明衰老对促炎细胞因子的分泌具有独特的、器官特异性的影响，而隔离应激似乎能持续促进大多数器官的炎症。
2. 社会隔离强烈诱导脂氧合酶衍生的氧化脂质形成
通过主成分分析（PCA）发现，衰老导致了脑、脂肪、心脏和脾脏的氧化脂质谱发生与年龄相关的明显改变。而老年小鼠隔离后，所有器官的氧化脂质谱集群分离更为显著（除心脏外，年龄的影响强于隔离）。在单个氧化脂素水平上，衰老导致了不同的器官特异性衰老特征：肝脏、肌肉和脾脏的氧化脂质总体减少，而脑、脂肪和肺的氧化脂质谱随年龄呈现分化变化。在心脏中，衰老导致氧化脂质量增加，尤其是前列腺素（PGs）。然而，由于隔离引起的社会应激，驱动了广泛的氧化脂质（特别是来源于5-、12-和15-LOX的氧化脂质）在多个器官系统中的显著增加。在肺和脾脏中，由12/15-LOX产生的具有炎症消退作用的SPMs（如RvD5和PDX）与来源于5-LOX的促炎性LTs一同升高。在脑和心脏中，氧化脂质水平大多不受老年小鼠隔离的影响。当根据其限速生物合成酶（即COX、5-LOX、12-LOX和15-LOX）对氧化脂质进行分类分析时发现，社会隔离应激持续上调了老年小鼠器官中LOX衍生的氧化脂质，而只有心脏，以及程度较轻的大脑，对社会应激相关的氧化脂质改变表现出较低的易感性。这些LOX衍生氧化脂质的增加在所有PUFA底物（即AA、EPA和DHA）的转化中都很明显。
3. 晚年运动无法挽救隔离对炎症状态的影响
研究人员进一步研究了运动是否能减轻社会隔离应激对炎症介质的影响。在8周重复社会隔离期间，为O-EX小鼠在隔离夜提供跑轮。O-EX（跑步者）组小鼠体重略有下降，但与O-ISO（非跑步者）组无显著差异，且体重减轻似乎与个体跑步表现相关。在细胞因子水平上，仅在肺中，运动导致IL-1β水平显著下降，而在其他器官中，IL-1β水平基本不变。其他促炎细胞因子在大多数器官（除脑外）有下降趋势，但无显著降低。脑中的IL-6水平甚至显著升高。IL-1ra水平在运动组和隔离组之间基本无变化。氧化脂质谱的主成分分析显示，比较O-ISO与O-EX时，所有器官均无明显差异。但在个别氧化脂质水平上，脂肪（增加）和肝脏（减少）中的氧化脂质水平受运动影响最大，特别是单羟基化脂肪酸如5-HETE、12-HETE等。按生物合成酶（即COX、5-、12-、15-LOX）分组分析显示，运动未引起任何器官的氧化脂质组发生显著变化，仅在脂肪和肝脏中观察到变化趋势。因此，对于经历社会隔离应激的老年小鼠，自愿运动对由隔离引起的大量氧化脂质和细胞因子水平改变的影响微乎其微。
4. 隔离状态下认知功能未从自愿运动中获益
通过Barnes迷宫测试评估经历重复隔离的老年小鼠的空间学习、短期和长期记忆。在训练期间，两个经历重复社会应激的组（O-ISO和O-EX）表现出随时间推移的相似改善。在探测试验（短期记忆）和滞留测试（长期记忆）中，未观察到运动带来的认知改善。在逆转测试（认知灵活性）中，O-EX小鼠表现出更短的主要潜伏期和更高的认知评分，表明在任务适应方面可能存在促进作用。总体而言，晚年运动干预似乎未能改善经历社会隔离应激的老年小鼠的空间学习、短期和长期记忆，但O-EX组表现出改善的认知灵活性。
5. 血清中与年龄相关的氧化脂质和蛋白质炎症库减少在隔离和运动后得以维持
为了确定观察到的与年龄、隔离及运动相关的器官特异性效应是否反映在系统循环中，研究人员对上述小鼠队列血清中的炎症分泌组（氧化脂质和蛋白质）进行了表征。基于氧化脂质谱的主成分分析和单个氧化脂质的详细分析，年龄（而非隔离或运动）是观察到的改变的主要驱动因素。血清中大多数筛查的氧化脂质因年龄而减少，5-LOX和15-LOX衍生产物变化显著。令人惊讶且与器官结果相反的是，隔离仅对血清中的氧化脂质水平有轻微影响。运动也未引起O-ISO组血清氧化脂质水平的显著变化。对血清中111种炎症相关细胞因子、趋化因子等的无偏分析显示，衰老导致大多数被研究蛋白质在血清中整体下调。然而，隔离导致82.9%的蛋白质表达增加。运动干预（O-EX）导致经历隔离的老年小鼠（O-ISO）发生更轻微、更平衡的变化。急性期蛋白（APPs）和趋化因子因年龄而受损。在O-ISO与O-GH比较中，促炎细胞因子IL-6、趋化因子CXCL1和脂多糖受体CD14增加。然而，经历隔离的老年小鼠运动后，诱导了更高水平的鼠C反应蛋白（CRP）、CCL11、CCL21和血管内皮生长因子（VEGF）。这些炎症相关血清标志物丰度的变化表明，随着年龄增长，免疫能力下降，并且隔离和运动引起了不同的促炎反应。
讨论与结论总结
社会隔离是晚年常见的现象，被广泛描述为发病率和死亡率增加的风险因素，并与更高水平的炎症和认知衰退相关。考虑到炎症是衰老、隔离和不活跃生活方式的共同特征，本研究检查了经历重复社会隔离和再社会化的小鼠的炎症细胞因子和氧化脂质分泌组，以及自愿体育锻炼是否能改善单笼饲养引起的炎症应激反应。出乎意料的是，研究人员发现社会隔离以器官特异性方式（尤其影响肝脏、肺和脾脏）导致炎症相关的LOX衍生氧化脂质显著升高。令人惊讶的是，体育锻炼对隔离小鼠的器官内在氧化脂质分泌组影响可忽略不计，并且在系统循环中也几乎不明显。先前的研究经常调查和描述社会隔离作为一种应激源，导致各种不良健康结果。这些事件的严重程度在很大程度上取决于社会隔离的类型和持续时间。尽管应激反应似乎不大，但长期隔离仍会促进促炎状态。本研究的结果证实，重复性社会隔离作为一种强效且有影响力的应激源，提升了多种促炎细胞因子。与之前的研究一致，研究人员没有发现促炎细胞因子和氧化脂质信号在多个器官中系统性上调，这进一步挑战了将普遍促炎微环境作为炎症老化主要表型特征的概念。此外，本研究揭示了由于隔离，几个器官中LOX衍生氧化脂质产生的显著上调，而由相同PUFA底物产生的COX产物几乎没有改变。IL-1β增加先前已与隔离相关的炎症表型相关联，但本研究首次证明了社会隔离应激对氧化脂质作为几个器官中炎症反应负责介质的巨大影响。由于促炎细胞因子和氧化脂质在双向炎症网络中紧密交织，研究人员认为必须评估这两种生物标志物类别，以评估社会隔离的免疫学后果。长期升高的单羟基化LOX衍生氧化脂质和促炎细胞因子与组织纤维化和器官损伤有关，因此怀疑重复社会隔离后升高的炎症分泌组可能加剧器官特异性炎症老化和年龄相关恶性肿瘤的发展。值得注意的是，这些与年龄和隔离相关的效应并未系统性地发生，这反映在小鼠血清中氧化脂质和细胞因子水平总体适度变化上。因此，血清中的生物标志物谱不能被认为是阐明由细胞因子和氧化脂质塑造的器官特异性炎症微环境的合适替代指标。社会隔离引起的氧化脂质形成的剧烈变化可能归因于下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴对社会隔离这种心理社会应激源的反应失调。已知氧化脂质，特别是类二十烷酸如PGs，可能受应激影响，并且应激可能影响COX-1和-2的表达。LOX表达同样被证明受应激信号调节。本研究目前的结果记录了老年小鼠由于社会隔离应激，几个器官和组织中LOX产物升高，主要是在脾脏、肝脏和肺等免疫器官中，这与上述应激对氧化脂质生物合成的影响非常一致。由年龄和隔离引起的炎症信号异常可能增加稳态失调的风险，导致慢性基础炎症。认知衰退也可能源于年龄和应激相关的氧化脂质失衡。在本研究中，老年小鼠的隔离既升高了主要具有促炎特征的5-LOX产物，也升高了12/15-LOX衍生的SPMs（如RvD5、PDX和MaR2）及其前体17-HDHA和14-HDHA，这些物质作为免疫消退剂终止和解决炎症。因此，氧化脂质谱的这些改变可能与应激诱导的先天免疫系统激活有关，触发中性粒细胞、单核细胞和单核细胞衍生巨噬细胞（氧化脂质的主要生产者）的动员。饮食或运动等生活方式干预是缓解或避免负面年龄相关健康结果的流行且充分表征的手段。运动已显示出抗炎特性，但这些特性高度依赖于类型、持续时间、开始时间和强度。例如，Sun等人发现，在暴露于感染损伤的年轻和老年小鼠中，长期运动（12个月自愿运动）确实减少了如IL-1β分泌等炎症老化特征。因此，进行运动的小鼠比久坐的小鼠更能免受脂多糖（LPS）攻击。然而，在年龄较大时开始运动方案的小鼠中，这种效果不那么明显，并且与表明身体活动的适应性和急性反应随着年龄增长而下降的结果一致。这也可能解释了为什么本研究的结果未证实先前的发现，即运动既刺激促炎也刺激抗炎的促消退脂质介质。与这些研究相反，本研究的运动方案在晚年（18月龄）开始，此外还有重复社会隔离和再社会化的应激因素。研究人员推测，社会隔离的有害影响压倒了体育锻炼的益处，因此未观察到运动对促炎特征的改善作用。虽然本研究的重复隔离和再社会化方案可能比目前的长时期隔离模型更好地模拟老年人的隔离，但应认识到几个局限性。过去的研究表明，社会隔离的影响以性别特异性方式发生，雌性小鼠通常比雄性受影响更大。此外，在晚年开始运动可能限制了其潜在益处，因为老年生物体的适应能力降低。尽管确定更早开始运动干预是否能减轻甚至预防负面社会隔离效应会很有价值，但研究人员有意评估运动作为对已确立社会隔离的直接对策。这种方法旨在更好地反映现实生活中在负面结果发生后实施干预的情景。最后，本研究未探讨重复社会隔离的有害影响是代表一种持续表型，还是可能通过持续的社会再整合逆转的短暂状态。
研究结论
本研究结果表明，重复的社会隔离和再社会化循环可能作为应激源，增加炎症相关细胞因子的分泌，并显著增强特定器官中LOX衍生氧化脂质的形成，从而影响炎症和组织稳态。值得注意的是，据研究人员所知，这是首次揭示社会隔离后器官特异性氧化脂质调节的报告，为未来炎症、衰老和社会隔离交叉领域的跨学科研究提供了一个新框架。在本实验条件下，自愿体育锻炼未能抵消社会隔离应激对氧化脂质产生的影响。总之，LOX衍生氧化脂质的显著升高凸显了社会隔离应激（老年人常见现象）对几个特定器官内炎症介质的影响，并提出氧化脂质作为应激相关炎症老化的决定因素。
