一种基于纳米抗体的蛋白质降解靶向嵌合体为多种流感病毒感染提供广谱保护

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：A nanobody-based proteolysis-targeting chimera offers broad-spectrum protection against diverse influenza virus infections

　　

摘要 甲型流感病毒（influenza A viruses）仍然是全球公共卫生的主要威胁。除了每年导致约3-5百万重症病例和29-65万死亡的季节性流行H1N1和H3N2亚型外，包括禽流感H5、H7和H9在内的其他亚型也显示出跨种传播潜力，导致多国发生数千例人感染。开发能够抑制不同流感病毒亚型的广谱抗病毒药物是减轻流感病毒引起疾病严重程度和降低死亡率的关键。在此，研究人员通过将核蛋白（nucleoprotein, NP）特异性纳米抗体（nanobodies, Nbs）融合到VHL（Von Hippel?Lindau）E3泛素连接酶的α结构域，构建了五种基于纳米抗体的蛋白质降解靶向嵌合体（nanobody-based proteolysis-targeting chimeras, Nb-PROTACs）。研究发现，其中两种嵌合体（VHL-Nb135和VHL-Nb170）能够有效诱导所有16种已知甲型流感病毒亚型（H1–H16）NP的降解。VHL-Nb135和VHL-Nb170在体外有效抑制了人流感病毒（H1N1, H3N2）和禽流感病毒（H5N1, H7N9, H9N2）的复制。在动物研究中，当通过腺相关病毒血清型LungM3（AAV-LungM3）将VHL-Nb170气管内给药至小鼠时，病毒在呼吸道的复制被显著抑制，分别有90%和80%的小鼠在感染致死剂量的H1N1和H5N1病毒后存活。该研究表明，Nb-PROTACs为开发针对流感病毒的广谱疗法提供了一个强大的平台，并具有作为创新性抗病毒候选药物进行临床转化的潜力。

研究背景与目的

甲型流感病毒（IAVs）是具有高度多样性的病原体，主要源自野生水禽，可引起包括人类在内的多种物种的传染性暴发。根据其表面糖蛋白血凝素（HA, H1–H19）和神经氨酸酶（NA, N1–N11）的抗原性或遗传特性，流感病毒被分为不同亚型。季节性流感主要由H1和H3亚型引起，而H5、H7、H9等多种禽流感病毒亚型已表现出人畜共患传播能力，对公共卫生构成重大威胁。疫苗接种和抗病毒治疗是应对流感病毒的两种主要策略，但HA基因的频繁突变导致抗原漂移，降低了疫苗效力，而现有抗病毒药物（如神经氨酸酶抑制剂、M2离子通道阻滞剂以及巴洛沙韦、法匹拉韦等新型药物）面临耐药性出现的挑战。因此，亟需能够靶向并抑制病毒组分，同时具有广谱抗病毒活性的创新策略。蛋白质降解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）是一种高效、选择性靶向降解蛋白的方法，其通过利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统识别并降解目标蛋白。纳米抗体因其分子量小、稳定性高、组织渗透性优异，成为传统抗体的重要补充。本研究旨在构建靶向流感病毒高度保守的核蛋白（NP）的新型纳米抗体PROTACs（Nb-PROTACs），评估其作为广谱抗流感疗法的潜力，相关成果发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

关键技术方法概述

本研究主要采用了以下关键技术：1) 分子构建与验证：基于已报道的五个靶向流感病毒NP的纳米抗体（Nb52、Nb77、Nb135、Nb170、Nb355），将其分别与人或小鼠VHL E3连接酶的α结构域融合，构建Nb-PROTACs表达质粒，并在人源（HEK293T、A549）及鼠源（MLE-12）细胞系中进行过表达和功能验证。2) 体外抗病毒活性评估：利用稳定表达Nb或VHL-Nb的细胞系，感染多种人源和禽源流感病毒株（包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2），通过噬斑测定法检测不同时间点的病毒滴度，评估抗病毒效果。3) 体内保护效力研究：使用临床相关递送载体——腺相关病毒血清型LungM3（AAV-LungM3），将鼠源化VHL-Nb170（mVHL-Nb170）通过气管内给药方式递送至BALB/c小鼠肺组织，随后用致死剂量的H1N1（PR8株）或H5N1（SD012株）病毒进行鼻腔攻击，监测病毒载量、体重变化和存活率。4) 作用机制探究：通过免疫共沉淀、蛋白质印迹、蛋白酶体/自噬-溶酶体途径抑制剂（MG132/LY294002）处理、以及利用CRISPR/Cas9技术构建ATG5基因敲除细胞系等方法，阐明了VHL-Nb170介导NP泛素化降解的具体分子通路。

研究结果

NP纳米抗体PROTACs的设计与验证

研究人员选择了五个靶向流感病毒NP的纳米抗体，将其与VHL的α结构域融合，构建了VHL-Nb嵌合体。通过将表达VHL-Nb或相应Nb的质粒与表达NP-eGFP（PR8株NP与eGFP融合）的质粒共转染293T细胞，发现与Nb相比，VHL-Nb共转染细胞中荧光强度显著降低，表明NP被降解。蛋白质印迹分析进一步证实，VHL-Nb135和VHL-Nb170降解NP的能力最强，分别将NP水平降至对照Nb组的30.0%和26.2%。在稳定表达这些蛋白的A549细胞中，VHL-Nb135和VHL-Nb170显著抑制了H1N1病毒的复制。

VHL-Nb135和VHL-Nb170可促进不同流感病毒亚型NP的降解

通过免疫共沉淀实验，证实VHL-Nb135和VHL-Nb170能与来自16个不同流感病毒亚型（H1–H16）的NP结合。进一步实验表明，这两种Nb-PROTACs均能有效促进这16个亚型NP的降解，展现了广谱降解活性。

VHL-Nb135和VHL-Nb170降低不同流感病毒在A549细胞中的复制

研究人员评估了VHL-Nb135和VHL-Nb170对五种代表性流感病毒的抗病毒效果，包括人季节性病毒（H1N1、H3N2）和具有人畜共患潜力的禽流感病毒（H5N1、H7N9、H9N2）。在稳定表达VHL-Nb135或VHL-Nb170的A549细胞中，所有五种病毒的复制滴度均显著低于表达相应Nb的对照组细胞。比较发现，VHL-Nb170对病毒复制的抑制效果优于VHL-Nb135。

VHL-Nb170对不同流感病毒在小鼠中的保护效力

鉴于VHL-Nb170在体外表现更优，研究人员评估了其体内保护效果。首先，构建了鼠源化的mVHL-Nb170，并在鼠肺上皮细胞MLE-12中证实其可抑制H5N1病毒复制。随后，使用AAV-LungM3载体将mVHL-Nb170递送至小鼠肺部。攻毒实验显示，与仅接受AAV-LungM3载体的小鼠相比，接受AAV-LungM3-mVHL-Nb170的小鼠在感染致死剂量H1N1或H5N1病毒后，其鼻腔和肺部的病毒载量均显著降低（H1N1感染小鼠肺内病毒载量平均降低94.51%，H5N1感染降低93.86%）。更重要的是，90%的H1N1攻毒小鼠和80%的H5N1攻毒小鼠存活下来，而对照组小鼠全部死亡。这证明Nb-PROTAC能有效抑制体内流感病毒复制，并提供显著保护。

VHL-Nb170介导的NP泛素化通过自噬-溶酶体途径降解

为阐明降解机制，研究人员发现VHL-Nb170能显著增强泛素与NP的结合。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理不影响NP降解，而自噬-溶酶体途径抑制剂LY294002则能显著抑制降解。在ATG5基因敲除的293T细胞中，VHL-Nb170介导的NP降解被显著削弱，证实了自噬-溶酶体途径的关键作用。进一步的免疫共沉淀实验确定，VHL-Nb170介导的泛素化NP特异性与自噬货物受体OPTN相互作用，从而被导向自噬-溶酶体途径降解。

讨论与结论

本研究成功开发了一种新型的纳米抗体PROTAC——VHL-Nb170，其展现出广谱抗流感活性。VHL-Nb170能降解所有16个HA亚型的NP，并抑制具有大流行潜力的人流感和禽流感病毒的复制。通过AAV-LungM3载体递送的mVHL-Nb170在小鼠模型中展现出卓越的保护效力，证明了其作为广谱抗病毒预防剂的临床转化潜力。研究发现，并非最强的抑制性纳米抗体能转化为最有效的PROTAC，降解效率取决于目标蛋白、E3连接酶及其他相关因子之间三元复合物的协同相互作用。与通常通过蛋白酶体途径降解的VHL介导的泛素化蛋白不同，本研究中VHL-Nb170介导的泛素化NP通过自噬-溶酶体途径降解，这与目标蛋白自身特性（如与特定自噬受体如OPTN的相互作用）有关。随着mRNA递送等新技术的进步，通过肺部递送Nb-PROTACs进行流感病毒治疗具有广阔前景。总之，该概念验证研究为开发针对流感病毒、冠状病毒等易发生抗原漂移/转换或逃逸宿主免疫的病毒的新型抗病毒策略铺平了道路。

研究结论翻译

总之，研究人员通过将纳米抗体转化为能够选择性降解流感病毒核蛋白的PROTACs，建立了一种新型抗病毒策略，并证明Nb-PROTAC能有效抑制不同流感病毒在体内和体外的复制。这项概念验证研究为开发针对多种病毒（特别是那些易发生抗原漂移或转换的病毒，如流感病毒和冠状病毒，以及逃避宿主免疫的病毒，如非洲猪瘟病毒）的新型抗病毒策略铺平了道路。