桦木酸与miR-21的调控、乳腺癌细胞的凋亡以及氧化还原变化有关：一项体外和计算机模拟研究

《Scientific Reports》：Betulinic acid is associated with miR-21 modulation, apoptosis and redox changes in breast cancer cells: an in vitro and in silico study

　　摘要
桦木酸（Betulinic acid）是一种疏水性五环三萜类化合物，主要存在于白桦树（Betula alba）的树皮中，以其抗癌活性而闻名，其作用机制包括上调促凋亡蛋白、调节NF-kB以及抑制拓扑异构酶I。本研究旨在探讨桦木酸单独使用或与多柔比星（doxorubicin）联合使用对人类三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）细胞的抗癌效果、分子靶点以及与miR-21调控的关联。我们通过MTT实验测定药物的细胞毒性，并通过流式细胞术分析细胞死亡机制。此外，还研究了桦木酸和多柔比星对miR-21下游调控因子HIF1A、PDCD4、PTEN和SMAD7表达水平的影响。最后，通过分子对接技术分析了桦木酸和多柔比星与这些靶点的结合亲和力及相互作用方式。总体而言，实验结果表明，在所测试条件下，桦木酸和/或多柔比星处理显著增加了细胞凋亡，下调了miR-21、HIF1A和SMAD7的表达，同时上调了PDCD4和PTEN的表达。分子对接分析提示桦木酸和多柔比星可能与PTEN和PDCD4发生相互作用，从而抑制细胞生长并诱导细胞死亡。总之，本研究表明桦木酸是一种具有调节miR-21表达潜力的抗癌化合物，并明确了其作用涉及的分子靶点。

引言
癌症最初被定义为一种组织肿块。在全球范围内，癌症占非传染性疾病（NCDs）导致的死亡人数的六分之一（16.8%）和四分之一（22.8%），成为二十一世纪重要的社会、公共卫生和经济问题。2022年全球报告的新发癌症病例接近2000万例。根据最新的GLOBOCAN 2022数据，超过5300万患者在确诊后存活五年以上，但该疾病每年仍导致970万人死亡。最常见的恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌，这些也是全球癌症相关死亡的主要原因。乳腺癌占所有癌症病例的11.7%，是女性发病率和死亡率最高的疾病之一（2022年新增病例230万例）。乳腺癌是159个国家癌症死亡的主要原因，也是女性癌症死亡的第二大原因，2022年导致约66.6万人死亡。乳腺癌是一种复杂的肿瘤，具有多种不同的亚型，这些亚型在分子和临床特征上存在差异。三阴性乳腺癌（TNBC）是其中一种亚型，具有严重的治疗和预后问题。TNBC占所有乳腺癌的15-20%，其特征是缺乏雌激素受体（ER）、孕酮受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达。TNBC是一组生物学上多样化的肿瘤，具有不同的转录组、基因组和表观遗传学特征，这可能导致临床结果和治疗反应的差异。

microRNA（miRNA）是一类重要的非编码RNA，对调控基因转录后表达起着关键作用。miR-21是最早被发现的致癌miRNA之一，它在乳腺癌的侵袭过程中起着重要作用，促进肿瘤生长和转移。miR-21通过攻击多种肿瘤/转移抑制基因而发挥致癌作用。由于其表达升高与淋巴结转移、肿瘤进展和不良预后相关，因此miR-21可作为乳腺癌的预后标志物。通过调控miR-21，可能有助于控制TNBC的致癌途径。

化疗旨在通过阻止肿瘤生长和细胞增殖来防止侵袭和转移。传统化疗药物通过干扰DNA、RNA或蛋白质的合成或抑制其正常功能来发挥作用，但同时也会对健康细胞造成损害。蒽环类药物，尤其是多柔比星（DOX），常用于乳腺癌的治疗方案中。多柔比星可以阻止细胞分裂并诱导恶性组织中的p53依赖性凋亡，但其使用既有即时影响也有长期后果，包括轻度至重度的毒性。多柔比星可通过神经炎症过程引起间接神经毒性，即使无法穿过血脑屏障，也可能导致认知问题。心脏毒性是癌症治疗中较为常见且危险的副作用之一，会影响患者的生活质量并增加死亡率。心脏毒性的表现为左心室射血分数（LVEF）下降。因此，使用天然物质可能是一种提高治疗效果的策略，既可以增强抗癌活性，也可以降低治疗相关的毒性。

近年来，来自微生物、植物和其他生物体的天然物质的抗癌特性受到了广泛研究。许多天然产物被癌症患者作为辅助和综合治疗手段使用，一些常用的抗癌药物也来源于天然来源。桦木酸（Betulinic acid，BA）是一种五环三萜类化合物，因其能够抑制肿瘤生长和阻止癌细胞增殖而受到广泛研究。通过多种机制，如抑制拓扑异构酶、活性氧（ROS）生成、通过线粒体系统诱导凋亡以及抑制NF-kB信号通路、转录因子和雌激素受体，桦木酸表现出显著的抗癌效果。此外，桦木酸还能阻断基质金属蛋白酶2和9（MMP-2和MMP-9）以及血管内皮生长因子和受体，从而发挥抗血管生成和抗转移作用。

多柔比星具有公认的抗癌潜力，桦木酸也在临床试验数据库（CTDBase: http://ctdbase.org/）中被记录。因此，本研究的目的是探讨桦木酸对三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）细胞的抗癌效果，特别关注氧化应激、细胞凋亡和miR-21调控的变化，并评估其与多柔比星联合使用的效果。同时，通过分子对接分析探索其与选定靶点的潜在相互作用。

材料与方法
**化学品和试剂**
桦木酸购自Adamas-beta Co., Ltd.（中国上海），多柔比星购自Sigma-Aldrich Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。所有细胞培养材料均购自Gibco（美国纽约）。
**细胞系**
人类乳腺癌MDA-MB-231细胞由美国典型培养收集中心（ATCC）提供。细胞在含有5% CO2的培养基中培养，温度为37°C。

**细胞毒性检测**
细胞活力通过MTT实验测定。具体操作如下：将MDA-MB-231细胞以15 × 10^3个/孔的密度接种在96孔板中，每孔加入100 μl新鲜培养基，培养24小时后，分别加入不同浓度的桦木酸（6.25–100 μM）和多柔比星（48小时）。培养结束后，向每个孔中加入20 μL（5 mg/mL）MTT试剂（SERVA Electrophoresis GmbH，德国海德堡；商品编号20395.01），并在37°C下孵育4小时。随后将形成的甲酚蓝晶体溶解在100 μL二甲基亚砜（DMSO）中，使用ELISA板读数仪在570 nm处测量光密度。通过剂量-反应曲线的非线性回归分析计算IC50值。

**细胞处理**
根据预先计算的IC50值对细胞进行处理，用于后续的细胞和分子分析。两种细胞系的处理方式如下：仅使用培养基或0.1% DMSO作为对照组；单独使用桦木酸或多柔比星处理；或同时使用桦木酸和多柔比星处理。处理前48小时进行实验，每个实验重复至少三次。

**凋亡和坏死评估**
使用FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD Bioscience，德国海德堡；商品编号556547）按照制造商说明进行检测。具体操作如下：收集漂浮的细胞，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次，然后重新悬浮在结合缓冲液中，最终细胞密度为10^6个/毫升。将含有10^5个细胞的100 μL细胞溶液与5 μl FITC-Annexin和5 μl PI混合。轻轻涡旋后，在室温下避光孵育15分钟。加入400 μl结合缓冲液后，使用FACS Calibur（BD Bioscience，德国海德堡）和Cellquest Pro软件（BD Bioscience）进行流式细胞术分析。

**RNA提取、cDNA合成和定量实时PCR**
使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，德国；商品编号217004）提取总RNA，并使用QuantiTect Reverse Transcription kit（Qiagen，德国；商品编号205311）将其逆转录为cDNA。具体操作如下：裂解细胞后，使用离心柱纯化总RNA，洗涤并洗脱，然后将cDNA反应混合物在42°C下孵育30分钟，随后在95°C下灭活3分钟。接着使用qPCR Master Mix kit（Enzynomics，韩国；商品编号RT500S）进行qRT-PCR，反应体积为20 μL，包括cDNA模板、正向和反向引物及SYBR Green混合液。qRT-PCR循环包括95°C下的10分钟变性、95°C下的40个循环退火（10秒）和72°C下的15秒延伸。HIF-1α、PDCD4、PTEN、SMAD7、miRNA-21、β-actin和U6基因的引物列于表2中。HIF-1α、PDCD4、PTEN和SMAD7的相对表达量通过2^-ΔΔCt方法计算，以内源性β-actin作为对照基因；miRNA-21的表达量以U6基因作为内源性对照。

**SOD和CAT活性测定**
超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性使用市售试剂盒（Bio-diagnostic，埃及吉萨；商品编号SD 25 21和CA 25 17）进行测定，具体操作按照制造商说明。具体步骤如下：使用裂解缓冲液裂解细胞，然后在4°C下以12,000 rpm离心10分钟，吸取上清液并丢弃沉淀物。SOD活性通过其抑制硝基蓝四唑还原的能力来测定，吸光度在560 nm处测量；过氧化氢（H2O2）分解速率用于测定CAT活性，吸光度在240 nm处测量。

**分子对接**
为了分析桦木酸和多柔比酸与HIF1A（目标位点PDB ID: 8HE3）、PDCD4（目标位点PDB ID: 2RG8）、PTEN（目标位点PDB ID: 1D5R）和SMAD7（目标位点PDB ID: 2DJY）的相互作用，首先从RCSB PDB数据库下载相关结构，并使用BIOVIA Discovery Studio Visualizer软件进行可视化处理。此外，还从PubChem数据库获取了桦木酸和多柔比酸的3D结构。使用InstaDock软件计算桦木酸和多柔比酸与这些靶点的结合自由能、结合亲和力（pKi）和配体效率。最后，使用BIOVIA Discovery Studio Visualizer软件展示靶点-配体相互作用。

**统计分析**
数据使用Graphpad prism 8.0.1（https://www.graphpad.com/）进行统计分析。数据以平均值±标准误差（mean ± SEM）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较检验比较组间差异，p < 0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次（n = 3）。

**结果**
通过MTT实验研究了桦木酸和多柔比酸对MDA-MB-231细胞增殖的影响，确定了它们的IC50值。与对照细胞相比，接受白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）治疗的细胞表现出剂量依赖性的生长抑制。BA和DOX的IC50值分别为64.3 μM和32.9 μM（图1）。图1：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。（A）白桦酸（BA）和（B）多柔比星（DOX）对MDA-MB-231细胞增殖的剂量反应曲线：细胞暴露于不同浓度的每种化合物（6.25–100 μM）48小时后，通过MTT测定细胞活力。数据表示为三次独立实验（n=3）的平均值±SEM，每次实验重复三次。曲线是使用对数浓度进行非线性回归分析生成的。IC50值是根据拟合曲线计算得出的。在暴露于BA和DOX 48小时后，MDA-MB-231细胞经历了细胞数量显著减少、活力下降以及形态学变化，包括正常结构的丧失、细胞萎缩变得圆润和皱缩、细胞质浓缩、膜粗糙度增加以及失去粘附在培养板表面的能力。在用BA+DOX处理MDA-MB-231后，观察到了最大的细胞毒性。相反，对照细胞有效增殖，达到了100%的汇合度，并且没有明显的形态学变化或死亡症状（图2）。图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。代表性照片显示了用单剂或联合剂量的白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）（分别为64.3 μM和32.9 μM）处理后的MDA-MB-231细胞的形态学变化。细胞在光学显微镜下以20倍放大率观察和拍摄。通过流式细胞术评估凋亡：MDA-MB-231细胞系用BA（64.3 μM）和/或DOX（32.9 μM）处理48小时，以研究药物对存活细胞和死亡细胞百分比的影响。如图3所示，BA+DOX处理与对照相比对MDA-MB-231细胞系有更强的坏死效应（P<0.0001）（图3D）。在用BA处理MDA-MB-231后检测到最高比例的凋亡细胞（56.8% ± 0.034）（图3C）。流式细胞术分析表明，在用DOX处理MDA-MB-231后观察到最低存活细胞数量的最高细胞毒性效应（12.2% ± 0.012）（图3B）。图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在用白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）单独及联合处理（IC50分别为64.3 μM和32.9 μM）48小时后，评估MDA-MB-231细胞的死亡机制。细胞用Annexin V-FITC和PI染色，通过流式细胞术分析。显示代表性点图（A）：活细胞百分比、凋亡（早期+晚期）细胞和坏死细胞（B、C和D）。数据表示为三次独立实验（n=3）的平均值±SEM，每次实验重复三次。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。带****的列内的平均值在（p<0.0001）时具有显著差异。BA和DOX对HIF-1α、PDCD4、PTEN、SMAD7和miRNA-21相对表达的影响：使用实时PCR检测HIF-1α、PDCD4、PTEN、SMAD7基因和miRNA-21的相对表达，这些基因的表达反映了MDA-MB-231细胞在用BA（64.3 μM）和/或DOX（32.9 μM）处理48小时后的变化与对照相比的情况。我们的结果显示，在单独和联合使用BA和DOX处理后，PDCD和PTEN基因的表达显著上调（P<0.0001），其中DOX组的表达最高（图4D和E）。另一方面，相同的处理导致HIF-1α（大约3.4倍）和SMAD7（大约5.5倍）基因的表达显著下调，在BA组中表达最低（图4A和B）。此外，BA和DOX的处理还显著下调了miR-21的表达（大约1.45倍和1.27倍），其中BA处理组的表达最低（图4C）。图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。实时PCR分析研究了在MDA-MB-231细胞中用白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）（IC50分别为64.3 μM和32.9 μM）处理48小时后，[缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）、程序性细胞死亡4（PDCD4）、磷酸酶和ten?同源物（PTEN）、SMAD7和miRNA-21]基因的表达情况（A-E）。表达水平根据β-actin进行了标准化，对于HIF-1α、PDCD4、PTEN和SMAD7，以及miRNA-21使用2^-ΔΔCt方法计算。数据提供的是三次独立实验（n=3）的平均值±SEM，每次实验重复三次。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。带****的列内的平均值在（p<0.0001）时具有显著差异。BA和DOX对抗氧化酶的影响：图5A和B的结果显示，在用BA（64.3 μM）处理48小时后，SOD和CAT活性显著增加（分别约为58.2%和76.4%），而DOX处理（32.9 μM）48小时后与对照相比显著降低（分别约为75.9%和83.4%），尽管BA+DOX处理的细胞的SOD和CAT活性相对于对照组有所增加。图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）（IC50分别为64.3 μM和32.9 μM）处理48小时对MDA-MB-231细胞的SOD活性（U/ml）和CAT活性（U/L）的影响（A-B），无论是单独还是联合使用。提供的数据是三次独立实验（n=3）的平均值±SEM，每次实验重复三次。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。带****的列内的平均值在（p<0.0001）时具有显著差异。分子对接研究：表3展示了BA和DOX与HIF1A（8HE3-A）、PDCD4（2RG8-B）、PTEN（1D5R-A）和SMAD7（2DJY-A）的分子对接情况。BA对PDCD4和PTEN的结合亲和力最高（pKi分别为6.6和6.75）。表3：BA和DOX与HIF1A、PDCD4、PTEN和SMAD7的分子对接。全尺寸表格。此外，BA对HIF1A的pKi为4.99，而BA的亲和力最低（pKi为4.62）。在HIF1A、SMAD7、PDCD4和PTEN中重新对接的共结晶配体分别显示在图6、7、8和9中。图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）中重新对接的共结晶配体，映射表面显示白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）占据HIF-1α的活性口袋。结合模式和相互作用使用InstaDock软件预测。最佳对接姿势基于结合亲和力得分选择。对接结果作为预测性和假设生成呈现。图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在SMAD7中重新对接的共结晶配体，映射表面显示白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）占据SMAD7的活性口袋。结合模式和相互作用使用InstaDock软件预测。最佳对接姿势基于结合亲和力得分选择。对接结果作为预测性和假设生成呈现。图8：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在程序性细胞死亡4（PDCD4）中重新对接的共结晶配体，映射表面显示白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）占据PDCD4的活性口袋。结合模式和相互作用使用InstaDock软件预测。最佳对接姿势基于结合亲和力得分选择。对接结果作为预测性和假设生成呈现。图9：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在磷酸酶和ten?同源物（PTEN）中重新对接的共结晶配体，映射表面显示白桦酸（BA）和多柔比星（DOX）占据PTEN的活性口袋。结合模式和相互作用使用InstaDock软件预测。最佳对接姿势基于结合亲和力得分选择。对接结果作为预测性和假设生成呈现。讨论：多柔比星是一种常用于治疗和控制多种癌症（如睾丸癌、乳腺癌和肺癌）的蒽环类药物。此外，这种药物通常被认为是治疗三阴性乳腺癌（TNBC）最有效的方法。然而，DOX已知会在某些人中产生心脏不良反应，包括急性冠状动脉综合征、心力衰竭和心电图改变。因此，研究可能改善DOX益处并潜在降低其毒性的新型天然化合物是减少治疗TNBC患者时毒性的方法之一。通过改变TNBC中的关键信号通路，白桦酸是一种众所周知的天然物质，可以引起细胞凋亡并防止肿瘤发生。此外，白桦酸还可以使癌细胞产生更多的活性氧（ROS），从而导致严重的氧化应激。然而，据我们所知，尚未有关于这种效应的分子靶点的研究。在本研究中，我们使用乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）作为具有侵袭性和有限治疗效果的三阴性乳腺癌的成熟模型。在本研究中，我们展示了BA和/或DOX处理与MDA-MB-231细胞的抗增殖和细胞毒性效应相关，其效力在测试条件下有所不同。MDA-MB-231细胞对DOX的反应更敏感，因为该化合物的IC50值低于BA。这一发现与DOX主要用于治疗三阴性乳腺癌的事实一致。初步观察表明，48小时的处理效果比较短暴露时间更为明显。BA处理显示出抗增殖效应，这与之前研究的结果一致，这些研究调查了BA有机盐处理后MDA-MB-231细胞的增殖减少。另一项研究报告称，BA以剂量依赖的方式抑制了SKOV3和SW626卵巢细胞系的增殖。许多近期报告，包括本研究，表明BA与其他化疗药物联合使用时具有有希望的化疗调节作用。BA对癌细胞的强抗癌活性与其对非恶性细胞的明显无细胞毒性形成对比。因此，已经注意到各种来源的非转化细胞，如成纤维细胞、黑色素细胞、神经细胞和外周血淋巴细胞，对BA的细胞毒性作用具有显著抵抗力。DOX公认的剂量依赖性心脏毒性归因于其对恶性细胞和非恶性细胞的已知细胞毒性作用。这种区别强调了将BA与传统化疗药物结合使用以增强抗癌活性同时可能降低副作用的潜在益处。此外，我们还研究了与这种抗增殖效应相关的潜在变化，如凋亡调节、坏死和基因修饰，因为没有进行正式的相互作用分析。我们进行了Annexin V/PI染色测定，以研究BA是否通过诱导凋亡来抑制乳腺癌细胞的增殖。许多报告将BA的抗癌效应归因于此；我们检查了单独和联合使用BA和DOX处理后的凋亡和坏死细胞死亡情况。我们的结果表明，在与其IC50值相对应的浓度下，BA与乳腺癌细胞中的凋亡特征相关。在MDA-MB-231细胞中，BA单处理时凋亡细胞死亡占主导。有趣的是，BA与DOX的联合使用使坏死细胞的数量增加了2.5倍。这些数据可能在未来的联合治疗研究中很重要，旨在绕过DOX耐药癌细胞中的主要细胞死亡机制——凋亡。广泛报道BA对各种癌细胞具有诱导凋亡的作用。Wang等人显示BA通过抑制SCD1诱导胆囊癌细胞的凋亡。Liu的研究表明BA通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬介导的凋亡并抑制肝细胞癌。Shen还验证了BA通过抑制NF-κB通路诱导ROS依赖的凋亡和S期停滞在人类多发性骨髓瘤中。许多临床情况，如炎症、心血管疾病、癌症和衰老，被认为受到氧化应激的显著影响。此外，氧化应激会导致细胞结构和功能的多种改变以及导致癌症的DNA突变。抗氧化剂可能在预防癌症等疾病的发生中发挥关键作用。研究和调查表明，桦木酸（BA）在对抗氧化应激方面具有显著的抗氧化效果。值得注意的是，桦木酸能够增强SOD和CAT等抗氧化酶的活性，这表明它可能在调节细胞氧化还原平衡中发挥作用。相反，多柔比星（DOX）则会降低抗氧化防御能力，这与它众所周知的促氧化特性一致。这些结果表明，桦木酸可能通过除诱导氧化应激之外的机制（如氧化还原调节和替代性凋亡途径）发挥抗癌作用。目前的研究表明，尽管氧化应激与癌细胞死亡有关，但桦木酸可能主要通过控制氧化还原稳态来发挥作用。因此，抗氧化酶活性与细胞毒性之间的关系可能非常复杂，并且取决于具体情境。

大约60%的人类基因的表达受到miRNA分子的控制，miRNA是一种小型、非编码的单链RNA。一个或多个基因的活性可能同时受到不同miRNA的调控。早期研究表明，miRNA分子在乳腺癌的发展中起着重要作用：它们可以通过抑制肿瘤抑制基因来促进肿瘤侵袭和转移，同时下调维持生理状态所必需的miRNA。miR-21能够调控乳腺癌细胞的侵袭和迁移。为了研究miR-21在调控乳腺癌细胞侵袭和迁移中的作用，我们研究了其对PTEN、SMAD7、HIF1A和PDCD4等基因的分子影响。经过48小时的桦木酸处理后，miR-21的水平低于对照组，而在桦木酸与多柔比星联合处理后，miR-21的水平进一步降低。

桦木酸已被证明对多种肿瘤具有抗癌作用，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌和胰腺癌。其生物活性与多个靶点相关，如NF-κB、P53、PI3K、ERBB2、STAT3、ERα和HIF-1α。HIF-1α是一种缺氧诱导因子，作为转录因子帮助细胞应对低氧环境，通过激活促进生存和适应的特定基因来发挥作用。HIF-1α通过激活VEGF（血管生长因子）、EPO（红细胞生成因子）和MMPs（基质金属蛋白酶）等基因，促进细胞迁移和组织侵袭，从而在乳腺癌的发生和扩散中起作用。我们的研究表明，与对照组相比，桦木酸与多柔比星联合处理后HIF-1α的表达受到抑制。

SMAD7属于SMAD蛋白家族，是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的关键细胞内调节因子。其在正常组织和恶性组织中的表达和活性差异显著，可能受到肿瘤环境及其他信号通路平衡的影响。在我们的研究中，桦木酸与多柔比星联合处理后，乳腺癌细胞系中的SMAD7表达水平最低。肿瘤抑制基因PDCD4对细胞分裂、凋亡和蛋白质翻译至关重要，最初被发现是在程序性细胞死亡过程中被激活的基因，后来被证实是一种强大的肿瘤抑制因子，在乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌和胰腺癌中常常下调。经过48小时的多柔比星处理后，再给予桦木酸处理，PDCD4的表达增加，表明桦木酸在肺癌治疗中具有显著效果。

PTEN基因对PI3K/AKT信号通路具有调节作用，对维持细胞死亡与存活之间的平衡至关重要。PTEN的丢失或突变会导致PI3K/AKT通路的不受控制激活，从而失去其调节功能，导致细胞增殖、抗凋亡能力增强以及细胞逃避正常调控过程。PTEN的丢失通常与血管生成、转移和细胞迁移增加有关，这些因素都有助于恶性肿瘤的生长和扩散。多柔比星处理48小时后，PTEN的表达水平最高。

我们的计算机模拟研究预测了桦木酸与HIF1α、PDCD4、PTEN和SMAD7之间的相互作用。分子对接结果显示，桦木酸可能与PTEN和PDCD4有潜在的结合作用，而多柔比星则可能与SMAD7有潜在的结合作用。桦木酸和多柔比星也可能与HIF1α有类似的相互作用。尽管分子对接研究揭示了桦木酸与这些靶点之间的潜在相互作用，但这些结论基于计算预测，仅具有预测性，并不能证实生物学效应或功能相关性。因此，应将对接结果视为提出假设的依据。

桦木酸的多效性——这一特性在许多天然化合物中都有体现——可能是其能够与多种分子靶点相互作用的原因。这些化合物通常同时调节多个信号通路，而不仅仅是单一蛋白质，从而产生协调的生物学效应。观察到的凋亡、氧化还原平衡和基因表达的变化可以归因于这种多靶点作用。先前的研究表明，桦木酸可以影响多种细胞过程，如氧化应激反应、凋亡控制和线粒体功能，这支持了其抗癌作用可能依赖于网络机制而非单一靶点相互作用的观点。

总之，本研究表明，桦木酸在 triple-negative 乳腺癌细胞中能够抑制miR-21的表达。我们研究了细胞毒性、凋亡和坏死诱导，以及其对miR-21相关通路的影响，这些通路会降低HIF1α和SMAD7的表达，同时增加PDCD4和PTEN的表达。值得注意的是，在测试浓度下，联合治疗与单一治疗相比表现出不同的生物学反应，但未进行正式的相互作用分析。此外，分子对接结果显示桦木酸可能与某些靶点有潜在的相互作用，但这些发现仍具有预测性，需要进一步研究来证实这些发现并阐明其背后的机制。