《Biomaterials》：Peptide display on small extracellular vesicles directs tissue-specific tropism and delivery of gene editing machinery
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Wooil Choi|Jorge RuizdelRio|Valerio Embrione|Devansh Agarwal|Katie Blecke|Ann C. Gaffey|Karl J. Wahlin|Brian P. Eliceiri加利福尼亚大学圣地亚哥分校外科系，拉霍亚
Wooil Choi|Jorge RuizdelRio|Valerio Embrione|Devansh Agarwal|Katie Blecke|Ann C. Gaffey|Karl J. Wahlin|Brian P. Eliceiri
加利福尼亚大学圣地亚哥分校外科系，拉霍亚，CA 92093，美国
摘要
小型细胞外囊泡（EVs）能够递送核酸和蛋白质治疗剂，从而促进组织修复。然而，目前很少有方法能够引导这些囊泡定向作用于特定组织。在本研究中，我们通过改造EVs使其表面展示一个与条形码引导RNA（gRNAs）相连的肽库来应对这一挑战。我们展示了如何将这些EVs系统性地施用于小鼠模型，并通过回收小RNA后进行PCR扩增和条形码测序来评估这些携带gRNAs的EVs的细胞摄取情况。由于肽库的设计与同一质粒上编码的特定条形码相关联，因此从组织中回收的条形码序列的后续测序揭示了EVs摄取与EVs表面展示的特定肽序列之间的关联。因此，我们克隆了候选肽基序，通过体内和体外实验进行了验证。除了基于条形码的组织分析外，这些携带gRNAs的EVs还在Cre-loxP R26 LSL-tdTomato报告基因小鼠模型中实现了功能性基因编辑。这些研究证明了将条形码gRNA载荷与EVs表面展示相结合的方法可以克服基于EVs的基因编辑疗法所面临的障碍。
章节摘录
引言
将寡核苷酸治疗剂递送到特定组织、细胞类型和亚细胞区室（如细胞核）仍然是基因治疗转化中的一个主要挑战。[1] 实现这种靶向治疗需要考虑体内的生物分布、生物屏障、清除机制、介导摄取的细胞表面分子以及大分子在细胞内的运输过程。[2],[3] 虽然合理的靶向策略可以基于已知的分子相互作用（例如……）
动物模型
所有动物实验均按照加利福尼亚大学圣地亚哥分校（UCSD）的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。我们使用了12至16周大的LSL-tdTomato（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J；JAX# 007914，The Jackson Laboratory）小鼠。这些小鼠处于12小时光照/黑暗的周期环境中。
细胞培养
我们使用人类胚胎肾（HEK）Lenti-X 293T（HEK 293T）细胞（Cat# 632180，Takara Bio）进行瞬时转染和EV生产。
双功能EV库的构建及其特性分析
为了验证能否通过优化EVs的摄取来提高其对特定组织的靶向性，我们用肽库改造了四跨膜蛋白CD63的第二个外环（图1A）。CD63在释放到培养基中的EVs上高表达[16],[22]，并且当其与各种结构域（如小表位标签或较大的荧光报告蛋白）结合时，仍保持其内源性运输和释放特性[23],[24]。为了在EVs表面展示肽序列，我们……
讨论
本研究表明，通过在富含EVs的蛋白质CD63上展示肽库的工程化EVs可以递送与内部条形码序列相连的基因编辑载荷，从而同时评估EV的靶向性和功能性载物的递送情况。这种系统的EV筛选策略克服了目前通过批量RNA测序和条形码回收来识别目标器官和细胞特异性靶向性的局限性。
CRediT作者贡献声明
Wooil Choi：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、软件开发、项目管理、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构思。Valerio Embrione：验证、软件开发、方法学设计。Jorge RuizdelRio：方法学设计。Katie Blecke：方法学设计。Devansh Agarwal：方法学设计。Karl J. Wahlin：资源协调。Ann C. Gaffey：资源协调。Brian P. Eliceiri：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源协调。
该实验室获得了Ionis Pharmaceuticals的资助支持用于EV靶向性研究。B.P.E.是Saragen Therapeutics的联合创始人。
资金支持
美国国立普通医学科学研究所（R35GM149245）、Hammond家族基金会以及Ionis Pharmaceuticals（ION-ARPA项目，编号36803，由B.P.E.负责）的基础研究资助。
已提交一项发明披露。B.P.E.是描述靶向EVs和EV库的专利申请的发明人之一。B.P.E.也是Saragen Therapeutics的联合创始人。其他作者声明没有利益冲突。
