《ACS Central Science》：Synthetic Surrogates of Collagen-Rich Microenvironments: Integrating Modular Bioactive Fibrillar Structure and Tunable Viscoelasticity via Multifunctional Assembling Peptides
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胶原蛋白为细胞外基质（ECM）提供结构、粘弹性和生物活性，其特性在器官间、健康与疾病状态间存在差异。在从生物学研究到再生医学的应用中，解析和控制这些特性仍然需要胶原蛋白富集组织的合成模拟物。研究人员设计了多功能胶原模拟肽，它们可自组装成三螺旋和纤维，并含有整合
胶原蛋白为细胞外基质（ECM）提供结构、粘弹性和生物活性，其特性在器官间、健康与疾病状态间存在差异。在从生物学研究到再生医学的应用中，解析和控制这些特性仍然需要胶原蛋白富集组织的合成模拟物。研究人员设计了多功能胶原模拟肽，它们可自组装成三螺旋和纤维，并含有整合素结合基序：GFOGER（完整胶原蛋白I中的一个结合位点）和RGD（变性的胶原蛋白I中可用的隐蔽结合位点）。这些多功能胶原模拟肽被整合到基于水凝胶的合成细胞外基质中，以赋予类似胶原的层次结构、粘弹性和具有模块化的生物活性。研究人员建立了使用超分辨显微镜对水凝胶内产生的纳米和微米结构进行成像的创新方法。物理组装的多功能胶原模拟肽在原本具有弹性的、共价交联的水凝胶中赋予了可调的、浓度依赖的粘弹性，其松弛半衰期跨越数量级，与软组织相似。值得注意的是，在具有生物活性纤维结构和粘弹性的合成细胞外基质中封装和培养的乳腺癌细胞形成了大且不断生长的球体。总体而言，这些模块化构件为创建胶原蛋白富集微环境的完全合成替代物提供了创新工具，有助于基础和转化生物学研究，并为合成细胞外基质赋予可调谐的粘弹性提供了框架。
研究背景与问题
细胞外基质（ECM）为细胞提供三维物理和生化微环境，对细胞行为有至关重要的影响。胶原蛋白I是结缔组织中含量最丰富的胶原蛋白类型，它通过形成纤维网络赋予ECM结构完整性和力学性能，包括粘弹性。粘弹性材料兼具固体（储存机械能）和流体（耗散机械能）的特性，其应力松弛行为，特别是松弛半衰期，显著影响细胞的铺展、分化、增殖和类器官形成。在疾病状态下，如癌症和纤维化，胶原蛋白的含量、结构和交联发生改变，进而改变微环境的生物物理和生化特性。例如，与健康或良性组织相比，许多恶性肿瘤组织表现出更高的粘弹性。为了深入研究细胞在三维胶原蛋白富集微环境中的行为，需要能够精确模拟天然ECM复杂特性的合成模型系统。然而，现有的合成细胞外基质系统在独立控制粘弹性而不改变基质刚度或固有生化信号方面存在挑战。此外，传统方法通常将整合素结合肽随机悬挂在聚合物网络上，无法模拟胶原蛋白纤维上天然整合素结合位点的特异性呈现。因此，开发一种能够整合胶原蛋白的纤维结构、可调谐粘弹性和模块化生物活性的完全合成系统，对于基础生物学研究和再生医学应用具有重要意义。
本研究发表在《ACS Central Science》，旨在创建一个能够捕获天然胶原蛋白富集ECM的结构、生物物理和生物活性复杂性的完全合成水凝胶系统，实现对粘弹性和生物活性的高度可调谐控制，以模拟一系列胶原蛋白富集微环境。研究人员基于前期设计的多功能胶原模拟肽进行构建，该肽可自组装成纤维状结构，允许光触发与聚合物大单体的共价交联，并可通过叠氮-炔化学进行正交修饰。本工作通过引入整合素结合序列、开发超分辨成像方法、系统研究粘弹性及细胞响应，为构建生物启发的合成微环境提供了创新工具和框架。
关键技术方法
为开展研究，研究人员运用了多项关键技术：
- 1.
多功能胶原模拟肽（mfCMP）的设计与合成：通过微波辅助固相肽合成技术，合成了两种含有不同整合素结合基序（GFOGER和RGD）的新型多功能胶原模拟肽序列，并通过加热反相高效液相色谱纯化，使用超高效液相色谱-串联质谱验证序列。
- 2.
结构表征与稳定性分析：利用圆二色光谱分析了多功能胶原模拟肽的三螺旋形成与热稳定性，测定其熔解温度和特征峰。
- 3.
纤维结构可视化：开发了一种结合水凝胶制备、铜催化叠氮-炔环加成荧光标记和直接随机光学重建显微镜的技术，首次实现了在共价交联水凝胶内部对自组装多功能胶原模拟肽纤维纳米/微米结构的超分辨率成像。
- 4.
材料流变学表征：使用应变控制流变仪，在剪切模式下对原位形成的水凝胶进行应力松弛测试，量化松弛半衰期，并通过广义麦克斯韦模型拟合数据，分析其粘弹性行为。
- 5.
三维细胞培养与表型分析：采用双层水凝胶封装策略，将T47D-GFP人乳腺癌细胞系（一种管腔A型乳腺癌细胞）封装在含有不同多功能胶原模拟肽组合的水凝胶顶层。通过活细胞成像、代谢活性检测、免疫荧光染色（针对F-肌动蛋白、Ki-67、β1整合素、分泌的ECM蛋白等）和图像分析，定量评估细胞球体生长、增殖、存活率和基质沉积。
研究结果
整合素结合多功能胶原模拟肽序列的设计
研究人员在前期设计的基础上，将整合素结合基序GFOGER和RGD整合到多功能胶原模拟肽的氨基酸序列中，分别命名为mfCMPa-G-az和mfCMPa-R-az。设计的关键是将结合序列置于延长的氢键结合块内，以确保其从三螺旋结构上呈现。通过计算工具可视化预测结构，并通过圆二色光谱证实了所有多功能胶原模拟肽在生理温度下均能形成稳定的三螺旋结构，并观察到多个熔解事件。其中，mfCMPa-G-az显示出最高的三螺旋稳定性。
可视化共价水凝胶中的多功能胶原模拟肽纤维结构
研究人员将整合素结合多功能胶原模拟肽共价整合到聚乙二醇-巯基水凝胶网络中。为了可视化水凝胶内部的纤维结构，他们利用多功能胶原模拟肽上的叠氮基反应手柄，通过铜催化叠氮-炔环加成反应进行荧光标记，并成功应用直接随机光学重建显微镜对水凝胶内部进行了超分辨率成像。成像结果清晰地显示了水凝胶内部存在类似胶原蛋白的纤维状结构，其长度在微米级，宽度在数百纳米级，与天然胶原蛋白纤维尺度相似。不含多功能胶原模拟肽的对照组水凝胶则未显示任何纤维结构。
探究多功能胶原模拟肽-聚乙二醇水凝胶网络的粘弹性
研究人员假设，多功能胶原模拟肽通过其物理相互作用（三螺旋内的氢键和纤维内的盐桥）在共价网络中充当物理交联点，这些物理交联的动态特性可以赋予水凝胶类似生物组织的粘弹性。流变学应力松弛实验证实了这一假设。在完全由不可逆共价键组成的弹性水凝胶中，几乎观察不到应力松弛。而随着多功能胶原模拟肽浓度的增加，水凝胶的松弛半衰期显著缩短，表现出更快的应力松弛行为。数据分析表明体系中至少存在三种松弛模式。重要的是，在达到溶胀平衡后，不同浓度多功能胶原模拟肽水凝胶的储能模量保持在同一范围，说明粘弹性的引入并未显著改变基质的平衡刚度，从而实现了粘弹性与刚度的解耦。
探索细胞对多功能胶原模拟肽的响应
为了探究合成基质的粘弹性和生物活性呈现方式对细胞行为的影响，研究人员将T47D乳腺癌细胞封装在三种不同配方的水凝胶中：弹性基质+悬挂肽、粘弹性基质+悬挂肽、以及由生物活性多功能胶原模拟肽纤维构成的粘弹性基质。培养7天后，细胞形态和生长表现出显著差异。在弹性基质中，细胞形成了小而均匀的球体。在含有非生物活性多功能胶原模拟肽的粘弹性基质中，球体体积显著增大。而在由生物活性多功能胶原模拟肽纤维构成的粘弹性基质中，细胞球体体积最大，并观察到纤维蛋白沉积增加以及β1整合素呈簇状分布的迹象。所有条件下细胞存活率均高于95%，且粘弹性条件下的细胞增殖标记物Ki-67阳性细胞比例有升高趋势，单位视野内的细胞数量也显著更高。结果表明，多功能胶原模拟肽赋予的基质粘弹性以及从纤维结构上呈现整合素结合位点的方式，共同促进了乳腺癌细胞球体的生长和增殖。
总结与讨论
在讨论部分，研究人员指出，这项工作建立了一个具有自组装结构的胶原蛋白启发、完全合成的细胞外基质，该基质可赋予三维细胞微环境可调的生物活性和粘弹性。所开发的超分辨成像方法为可视化水凝胶内部的层次结构提供了新工具。多功能胶原模拟肽作为物理交联点，为合成基质引入应力松弛提供了新的框架。未来的研究可以基于此框架整合其他肽-蛋白质材料，或使用具有更强稳定性的胶原模拟肽构建单元，以开发性能更优的生物材料。多功能胶原模拟肽-聚乙二醇水凝胶平台还可进一步用于研究基质粘弹性和纤维化整合素结合如何影响细胞的力传导、分化等重要过程。
研究结论
总之，研究人员构建了一个具有完全合成的水凝胶系统，它包含了在许多天然胶原蛋白富集细胞外基质中存在的结构、生物物理和生物活性复杂性。该系统的生物活性和粘弹性高度可调，可用于模拟三维细胞培养研究的微环境。基质的可调特性源于对自组装纤维状多功能胶原模拟肽的使用，这些肽在其氨基酸序列中设计了整合素结合基序GFOGER和RGD。为了在溶胀平衡的水凝胶中可视化它们，研究人员开发了水凝胶制备技术以实现直接随机光学重建显微镜成像，阐明了层次化的多功能胶原模拟肽结构在光交联聚合物-肽合成细胞外基质中的形态。此外，研究人员证明当引入多功能胶原模拟肽时，这些细胞外基质模拟物具有粘弹性，这可能是由于多功能胶原模拟肽组装结构之间的物理连接所致。值得注意的是，增加多功能胶原模拟肽浓度会导致更快的应力松弛，因为物理性多功能胶原模拟肽交联的比例增加了。受胶原蛋白富集肿瘤微环境的启发，T47D乳腺癌细胞被封装在具有应力松弛功能的生物活性多功能胶原模拟肽细胞外基质中，形成了大且不断生长的细胞团簇，而在弹性聚合物-肽材料中细胞团簇的形成有限。总的来说，研究结果表明，可以使用生物活性、层次组装的肽材料形成并调节完全合成的、受胶原蛋白启发的微环境，作为生物材料和细胞培养应用的平台，并为控制合成基质内的粘弹性提供了框架。
