基于乳转录组衍生的变异解析荷斯坦牛乳腺亚临床感染宿主应答特征

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Transcriptome-derived variants in milk reveal host response signatures to subclinical intramammary infection in Holstein cattle

　　

摘要 背景：除了常规的转录组分析，RNA测序（RNA-Seq）能够发现与复杂性状（如乳房炎抗性或易感性）相关的表达基因内部的变异。在本研究中，研究人员对无乳房炎史的未感染荷斯坦牛（阴性组，Neg，n=9）或由原藻（Prototheca）属（P+，n=11）或无乳链球菌（S. agalactiae， Sa+，n=11）引起的乳腺亚临床感染（sIMI）的牛只的乳体细胞进行了RNA-Seq。目的是鉴定在特定微生物学条件下可检测到的、可能有助于调节宿主转录应答的转录组衍生的序列变异。通过将这些转录衍生变异与数量性状基因座（QTL）注释和富集分析整合，研究人员旨在突显与乳房炎易感性或恢复力功能相关的基因组区域。 结果：使用CLC基因组工作台，研究人员在Neg、P+和Sa+组中分别检测到306,440、264,132和246,777个独特变异，其中单核苷酸多态性（SNP）比插入缺失（INDEL）更丰富。在与免疫相关的基因（TNIP1、TNIP3、IL10RB、IL2RA、IL15RA）中鉴定出高影响变异，表明在不同微生物条件下免疫和炎症反应存在转录后调控。非编码调控区域的变异表明转录控制也可能影响宿主易感性。使用GALLO（Genomic functional Annotation in Livestock for positional candidate LOci）进行的QTL富集分析显示与产奶性状存在一致的关联，而临床乳房炎QTLs在P+组中特异性富集，反映了免疫反应的上下文依赖性调控。 结论：这些发现为乳腺感染的宿主应答分子基础提供了新见解，并支持了转录组驱动方法用于变异发现的价值。在免疫相关基因和调控区域中鉴定出的变异表明，免疫基因调控和转录后调控都可能影响对sIMI的易感性。经过进一步的功能验证，这些发现可能为通过精准育种策略提高奶牛乳房炎恢复力提供信息。

论文解读

一、 研究背景、目的与意义

乳房炎是奶牛养殖业面临的主要挑战之一，对生产力和动物福利均有负面影响。其中，由传染性病原体引起的乳腺亚临床感染（sIMI）由于缺乏明显临床症状，诊断常被延迟，导致感染在牛群中蔓延。原藻（Prototheca）属等非细菌性病原体对常规治疗具有天然抗性，使得防控尤为困难。鉴于抗生素耐药性日益严峻，增强牛只对病原体的天然抗性成为减少对抗生素依赖的潜在策略。奶牛对乳房炎的整体抗性遗传力低，传统的谱系选择策略效果有限。基因组学方法，特别是针对乳制品复杂多基因性状的方法，成为一种有前景的替代方案。RNA测序（RNA-Seq）技术能从表达基因中经济高效地发现编码序列变异（如SNP和INDEL），为解析功能相关的致病性变异提供了可能。然而，据研究人员所知，尚无研究应用此技术专门针对sIMI，现有研究多依赖于SNP芯片或DNA测序方法。

因此，本研究旨在鉴定荷斯坦牛在不同乳腺微生物学条件下（无感染阴性组Neg、原藻感染组P+、无乳链球菌感染组Sa+）的乳体细胞RNA中可检测到的转录组衍生序列变异。通过整合这些变异与QTL图谱分析，研究人员期望识别与乳房炎易感性或恢复力功能相关的基因组区域。这种双层策略有望为理解不同微生物条件下的转录变异提供新见解，并有助于筛选后续功能与基因组验证的候选位点。本研究论文发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》杂志。

二、 主要技术方法

本研究的主要技术方法包括：

1. 1.
   样本队列：研究在意大利威尼托地区一个商业牛场（450头泌乳荷斯坦牛）中进行，基于严格的纳入标准（无临床症状、无乳房炎史、无药物治疗、>120天泌乳日龄的多胎牛）筛选出三组动物：微生物检测阴性组（Neg，n=9）、原藻阳性组（P+，n=11）和无乳链球菌阳性组（Sa+，n=11）。
2. 2.
   RNA提取与测序：在确认微生物状态的采样点（T1），无菌收集个体混合乳样本。从乳体细胞中提取总RNA，使用DNBSEQ-G400平台进行双端150bp的RNA-Seq。
3. 3.
   变异检测与功能预测：使用CLC Genomics Workbench软件，以牛参考基因组ARS-UCD1.3为参照，对每个实验组内所有样本的测序数据进行合并比对，再进行变异检测，识别单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（INDEL）。通过Ensembl的变异效应预测器（VEP）评估变异的功能后果（如高、中、低、修饰影响）和SIFT评分，并预测氨基酸变化和剪接效应。
4. 4.
   QTL注释与富集分析：利用R包GALLO，将候选变异位点与牛QTL数据库进行注释，并在染色体水平进行富集分析，以识别在特定条件下过度富集的QTL性状，假发现率（FDR）<0.05视为显著。

三、 研究结果

Variant calling from RNA-Seq data

对31个样本的RNA-Seq分析共检测到1,345,001个变异。在剔除各组共有的变异后，研究人员专注于各组特有的变异进行分析。

Condition-specific detected variants

• •
  Negative group：在阴性组中独特检测到305,115个变异，其中SNP占82.99%，插入（INS）占9.28%，缺失（DEL）占7.73%。预测有273个变异（122个SNP，97个INS，54个DEL）可能影响剪接。VEP分析显示，绝大多数SNP和INDEL是内含子变异（修饰影响）。在编码区变异中，41%的SNP为错义变异。高影响变异定位于如IL15RA、IL2RA、IRF6、MYPC1等免疫相关基因。
• •
  Prototheca spp.-positive group：在P+组中独特检测到262,822个变异，其中SNP占81.75%，INS占9.73%，DEL占8.56%。有252个变异（90个SNP，99个INS，63个DEL）被预测影响剪接。VEP分析显示，大部分SNP和INDEL为内含子变异（修饰影响）。编码区SNP中43%为错义变异。高影响变异定位于如IKZF3、CX3CL1、BOLA-DQB、TNIP1、IL10RB、TLR6等免疫相关基因。
• •
  S. agalactiae-positive group：在Sa+组中独特检测到245,598个变异，其中SNP占82.27%，INS占9.29%，DEL占8.46%。有185个变异（94个SNP，45个INS，46个DEL）被预测影响剪接。VEP分析显示，绝大多数SNP和INDEL为内含子变异（修饰影响）。编码区SNP中44%为错义变异。高影响变异定位于如IRF6、PDE4D、TNIP3等免疫相关基因。

QTL annotation and enrichment analysis

QTL注释结果显示，与候选变异位点共同定位的QTLs中，与产奶（Milk）相关的QTL类别在所有组中均占主导（约41%），其次是与肉质和胴体（Meat and Carcass）相关的QTL。健康（Health）相关的QTL类别在不同组中排名有所差异，在Sa+组中排名第三（13.16%）。

富集分析（FDR < 0.05）进一步揭示了组间特异的QTL富集模式：

• •
  Negative group enriched QTLs：Neg组有36个性状被显著富集，其中18个属于产奶性状，特别是乳脂和脂肪酸含量。健康相关性状包括牛呼吸道疾病易感性、蜱虫抗性和粪便幼虫计数。
• •
  Prototheca spp.-positive enriched QTLs：P+组有35个性状被显著富集，其中15个与产奶性状相关，如乳脂和脂肪酸组成。值得注意的是，临床乳房炎（BTA 17）在此组中被特异性富集。
• •
  S. agalactiae-positive enriched QTLs：Sa+组有54个性状被显著富集，其中24个与产奶性状相关，如乳钾、ω-6脂肪酸含量等。健康相关性状包括牛呼吸道疾病易感性、副结核分枝杆菌易感性和真胃变位。
• •
  sIMI groups enriched QTLs：P+和Sa+组共享19个显著富集的性状，主要与产奶（特别是脂肪酸含量）相关，健康相关性状包括牛呼吸道疾病和酮病。

四、 讨论与结论

本研究讨论了在荷斯坦牛不同乳腺感染条件下，乳体细胞转录组中存在的序列变异特征及其潜在生物学意义。

Variant profile and predicted functional impact

研究发现SNP比INDEL更为丰富，这与哺乳动物基因组的普遍规律一致。在三个实验组中均鉴定出预测具有高影响的变异，其中许多位于免疫相关基因，且部分基因在之前基于同一样本集的差异表达分析中也被识别出来，例如TNFAIP3相互作用蛋白1（TNIP1）和3（TNIP3）、白细胞介素10受体β亚基（IL10RB）、白细胞介素2受体α亚基（IL2RA）和白细胞介素15受体α亚基（IL15RA）。研究人员对这些基因中特定变异的潜在功能影响进行了细致探讨，认为它们可能通过影响炎症信号通路（如NF-κB和Toll样受体信号）的调控，在宿主对不同病原体（原藻的慢性感染特性与无乳链球菌的较强免疫激活特性）的应答差异中发挥作用。这些变异更多是可能微妙地调节剪接效率、转录本稳定性或信号转导，而非导致主要的异构体变化，体现了细胞因子信号通路在乳房炎易感性中的可塑性。

Variants effect on regulatory elements

研究还关注了在非编码调控区域的变异，特别是那些与长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）相关的变异。例如，在阴性组中发现一个SNP位于一个在乳房炎动物中表达下调的lncRNA（ENSBTAG00000050065）区域内。在P+和Sa+组中，分别在不同位置发现了位于bta-miR-155下游区域的SNP。bta-miR-155在免疫应答中具有双重作用，可能在不同病原体感染背景下，通过调节巨噬细胞存活或T细胞活性，影响宿主的免疫反应模式。这些非编码区域的变异可能通过影响基因表达的调控网络，成为决定疾病易感性和进程多样性的重要因素。

QTL enrichment patterns

QTL注释和富集分析结果显示，与产奶性状相关的QTL在所有组中都占主导，这可能反映了数据库的偏倚，但也可能揭示了产奶性状与乳房炎抗性之间的真实遗传关联（例如基因多效性或连锁不平衡）。特别值得注意的是，临床乳房炎QTL在P+组中特异性富集，这可能反映了针对原藻感染的宿主应答具有独特的遗传调控背景。整合功能基因组数据（如QTL）与转录衍生变异，有助于在复杂的多基因性状（如乳房炎抗性）研究中，为候选区域提供生物学背景并进行优先排序。

Conclusions

这些发现为乳腺感染的宿主应答分子基础提供了新见解，并支持了转录组驱动方法用于变异发现的价值。在免疫相关基因和调控区域中鉴定出的变异表明，免疫基因调控和转录后调控都可能影响对sIMI的易感性。经过进一步的功能验证，这些发现可能为通过精准育种策略提高奶牛乳房炎恢复力提供信息。