Nanopore长读长测序助力面肩肱型肌营养不良症的胚胎植入前单基因遗传病检测

《Neurology Genetics》：Proband Nanopore Long-Read Genome Sequencing Facilitates Preimplantation Genetic Testing for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy

背景与目的：面肩肱型肌营养不良症1型(FSHD1)由4q35区域D4Z4重复阵列收缩所致，体细胞嵌合病例的基因诊断难度较高，传统短读长测序无法直接解析致病单体型。本研究旨在建立基于Nanopore超长读长测序的精准单体型解析策略，并验证其在胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT-M)中的临床应用价值。 方法：一名携带体细胞嵌合FSHD1的男性患者接受Nanopore超长读长测序，直接跨越D4Z4重复阵列识别收缩事件，区分正常与致病单体型。随后结合短读长测序与Sanger测序对该患者来源的胚胎进行携带者状态筛查，最终采用Bionano光学基因组图谱(OGM)进行产前验证。 结果：Nanopore测序在4qA区域检出含4、16、33个D4Z4重复单元的3种单体型，证实体细胞嵌合状态。超长读长可在下游单核苷酸多态性(SNP)有限的情况下直接识别含4个重复单元的致病单体型并完成精准单体型定相。甲基化谱分析证实致病等位基因低甲基化。8枚活检胚胎中，5枚明确归类为未受累，2枚在224kb区域内发生上游重组，1枚携带致病单体型。整合Nanopore、短读长测序与Sanger测序解决了不确定病例并降低误分类风险。移植未受累胚胎后成功分娩健康婴儿，产前OGM验证显示D4Z4重复单元数为17和33，无收缩现象，与植入前结果一致。 讨论：Nanopore超长读长测序可精准检测体细胞嵌合FSHD1的D4Z4重复收缩并完成单体型解析，克服了传统短读长测序的局限性。应用于PGT-M可确保胚胎诊断可靠性并成功阻断疾病传递，支持超长读长测序在涉及复杂重复介导位点的神经系统疾病基因检测与诊断中的广泛应用潜力。

《Neurology Genetics》发表的这项研究针对面肩肱型肌营养不良症1型(FSHD1)的遗传检测难点展开。FSHD1约占FSHD的95%，由4号染色体4q35区域D4Z4串联重复阵列收缩至≤10个重复单元，且位于允许性4qA单体型上引发——该单体型可提供稳定DUX4表达所需的polyA信号(PAS)。D4Z4单个重复单元长3.3kb，整个重复区域超过100kb，传统短读长测序无法直接解析单体型，尤其体细胞嵌合（占FSHD病例14%~20%）的诊断难度更高。当前胚胎植入前单基因遗传病检测(PGT-M)无法直接检测胚胎活检的微量DNA中的D4Z4阵列大小与单体型，依赖间接标记法，存在重组风险且难以应对嵌合病例，因此亟需开发更精准的检测策略。

研究人员采用的关键技术方法包括：对先证者外周血进行Nanopore超长读长测序，使用端粒到端粒(T2T)参考基因组进行比对与单体型构建；采用Bionano光学基因组图谱(OGM)独立估算D4Z4重复数；对8枚囊胚活检样本进行全基因组扩增(WGA)后，联合短读长测序、Sanger测序验证单体型；产前通过羊水细胞OGM验证胚胎检测结果。

研究结果如下：

临床特征与生殖史：先证者为24岁男性FSHD患者，表现为双上肢进行性无力5年余、左下肢无力6个月，伴翼状肩胛、双侧肩胛突出、左小腿腓肠肌萎缩及双下肢围不对称（左33cm、右39cm）。其配偶2019年曾发生孕8周稽留流产，2022年11月于中山大学附属第一医院生殖医学中心寻求PGT，经促排卵获8枚囊胚。

患者Bionano OGM检测：检出3种D4Z4重复阵列单体型，分别为4（4qA）、16（4qA）、33（4qA）个重复单元，符合FSHD1诊断，证实体细胞嵌合状态。

患者Nanopore检测：共产生7160327条读长，平均长度35241.5bp，88.3%读长质量值＞10。以T2T-CHM13为参考基因组，Integrative Genomics Viewer(IGV)与Ribbon可视化分析显示：单体型1(Hap1)读长覆盖完整D4Z4区域（正常单体型），单体型2(Hap2)无完整覆盖，且包含4次与16次D4Z4重复的两种致病单体型。连锁碱基位点分析进一步区分正常与致病单体型，上游检出20个杂合SNP，下游仅检出1个杂合SNP（chr4:193552927，G/A）。

患者甲基化水平分析：Nanopore测序保留甲基化信息，通过nanopolish与DSS分析发现，Hap2的致病区域（chr4:193436060-193539568）存在16个差异甲基化区域，甲基化水平均低于Hap1，证实致病单体型低甲基化；10q26区域D4Z4位点甲基化变异幅度小于4q35，与既往报道一致。

家系样本高通量检测单体型：8枚胚胎活检的高通量测序显示，致病区域上游最后一个有效SNP距致病区224kb，存在重组风险，其中胚胎3(E3)、胚胎5(E5)、胚胎7(E7)在正常与致病链间发生重组。

家系样本Sanger验证：针对224kb空白区的6个SNP进行Sanger测序，证实E5、E7在致病区域上游224kb内发生重组，E3未发生该区间重组。整合数据后明确：E1、E2、E4、E6、E8继承先证者正常单体型；E3上游重组但致病区域附近为正常单体型；E5、E7携带致病单体型相关SNP。

胎儿羊水产前OGM检测：移植E1后获得临床妊娠，孕17周3天行羊水穿刺，OGM检测显示胎儿D4Z4重复单元数为17和33（4qA单体型），无致病性收缩，与植入前结果一致，2024年经剖宫产分娩健康男婴。

讨论部分指出，本研究首次将Nanopore超长读长测序用于体细胞嵌合FSHD的PGT-M，突破了传统方法的局限：直接跨越D4Z4重复区域实现精准单体型解析，无需依赖下游有限SNP；针对嵌合病例，基于单体型的分析比单纯重复计数更适合PGT风险评估——即使16个重复的非致病单体型也存在进一步收缩为致病变异的潜在风险。研究中联合短读长测序、Sanger测序填补了224kb的重组盲区，避免了等位基因脱扣(ADO)导致的误诊，产前OGM验证了结果的可靠性。研究局限性在于超长读长覆盖D4Z4区域的读长数量有限，无法准确计算嵌合比例，且难以区分胚胎继承的是4个还是16个重复单元的致病单体型。总体而言，该研究为FSHD等复杂重复介导的神经系统疾病的基因诊断与家族阻断提供了高效的新策略。