空间转录组学发现了一类新的成纤维细胞簇，这些细胞会促进肺腺癌的进展

《Clinical and Translational Discovery》：Spatial transcriptomics reveals a new cluster of fibroblasts to promote the progression of lung adenocarcinoma

　　摘要

背景：与癌症相关的成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）的关键组成部分，它们在各种癌症疾病中促进肿瘤进展和药物耐药性。空间转录组学作为一种强大的工具，用于阐明细胞在组织中的空间分布和异质性基因表达，为许多关于TME的研究提供了支持。本研究旨在利用空间转录组学和实验验证来阐明肺腺癌（LUAD）中成纤维细胞亚型的空间分布、分子特征和功能机制。

方法：我们的研究应用了时空增强分辨率组学测序（Stereo-seq）技术来研究成纤维细胞与肺癌细胞之间的相互作用。我们建立了A549肺癌细胞和HFL1成纤维细胞的共培养系统，以验证所鉴定成纤维细胞亚型的功能作用。通过基因敲低、增殖、迁移、侵袭和ELISA实验来研究潜在的机制。

结果：空间转录组学揭示了LUAD组织中的显著异质性，并鉴定出一个新的成纤维细胞簇（C0），其特征是POSTN、THY1、BGN和COL1A1的高表达，该簇与恶性上皮细胞（C5）在高恶性区域共定位。公共数据集分析确认C0为CAFs，在LUAD中富集，并与不良预后相关。配体-受体分析突出了C0和C5之间的胶原蛋白I和纤维连接蛋白1介导的相互作用。体外共培养显示A549可诱导HFL1分化为CAFs，同时上调COL1A1、COL1A2和CAF标志物。在成纤维细胞中敲低COL1A1或COL1A2显著降低了胶原蛋白I的分泌，并减弱了癌细胞的增殖、迁移和侵袭，但对血管生成的影响最小。

结论：这些发现不仅为肺癌组织的分子图谱提供了依据，还揭示了TME中成纤维细胞与癌细胞之间的新的共定位关系。我们的结果突显了CAFs作为有前景的治疗靶点的潜力，补充了针对基因突变和免疫细胞的治疗方法。

1 引言

肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，每年估计有200万新病例和176万死亡病例。尽管已经发现了多种分子靶点并显著改善了临床结果，但没有可靶向改变的患者仍然面临不良预后。除了对基因突变的努力外，免疫检查点抑制剂和抗血管生成剂也为与肿瘤微环境（TME）相关的癌症疗法提供了新的见解。TME的异质性在肿瘤发生、进展、复发和药物耐药性中起着关键作用，因此它作为肿瘤学研究和临床实践中的潜在治疗靶点受到了极大的关注。TME中的细胞组织和相互作用对进一步研究具有重要意义。空间转录组学能够将基因表达映射回肿瘤组织中的原始位置，使得细胞间通讯和组织异质性的研究成为可能。这项技术已被应用于多种研究，例如急性肾损伤、胰腺导管腺癌、心肌梗死等，提供了整个组织切片上基因转录本的二维图谱。在肺癌研究中，最近的研究表明TME中的巨噬细胞与免疫检查点阻滞剂的耐药性有关。空间转录组学还揭示了肺癌脑转移中TME的特性，并显示免疫状态和纤维化状态具有重要意义。尽管空间转录组学产生了大量数据，但仍需要进一步详细和深入的研究以及实验验证。与癌症相关的成纤维细胞（CAFs）是TME的主要组成部分，以其促进癌症进展的能力而闻名。在肺癌中，CAFs通过旁分泌信号传导、细胞外载体、生态位形成和营养供应来促进癌变和肿瘤进展。然而，CAFs缺乏特异的生物标志物。据报道，desmin（DES）、vimentin（VIM）、平滑肌肌动蛋白-α（ACTA）、成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）和血小板衍生生长因子受体α和/或β（PDGFRA/B）在CAFs中高度表达。CAFs还分泌促炎细胞因子，如白介素（IL）-1β、细胞色素c氧化酶亚单位II、C-X-C基序趋化因子配体1。CAFs的亚型，其特征是肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）7的表达，与患者对靶向治疗的反应相关。Roya Navab等人比较了肺癌中的CAFs和正常成纤维细胞，发现了由转化生长因子（TGF）-β信号通路调节的细胞外蛋白相关的显著差异。此外，癌细胞可以将正常基质细胞转化为CAFs。据报道，TME中的促炎细胞因子如LIF、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）α可以诱导成纤维细胞的表观遗传转换并维持CAFs的表型。这些促炎细胞因子还可以驱动间充质干细胞转化为CAFs。然而，成纤维细胞分化为CAFs的机制尚未得到充分理解。我们的研究利用来自肺腺癌（LUAD）患者肺组织样本的空间转录组学数据，关注成纤维细胞与癌细胞之间的细胞通讯。我们进一步使用HFL1和A549的共培养系统来探讨TME中的成纤维细胞促进肿瘤生长的机制。我们期望这些发现将揭示CAFs在肿瘤生长中的影响，并指导针对LUAD的创新疗法的发展。

2 方法

2.1 样本收集和储存

从五位接受肺切除术的早期LUAD患者中收集组织样本。所有患者均已签署知情同意书，同意组织和临床数据的收集，该同意书得到了复旦大学中山医院机构伦理委员会的批准（许可号B2021-265）。收集了五个肿瘤样本、六个正常样本和两个泛癌症样本。每个样本应大于1×1×2厘米，以确保有足够的材料进行后续处理。组织被嵌入最优切割温度化合物中，并在液氮制冷的异戊烷中冷冻。样本存储在-80°C，直至使用。

2.2 样本处理和空间转录组的生物信息学分析

组织被冷冻切片用于空间转录组学分析。应用了时空增强分辨率组学测序技术。测序和数据分析的详细程序已在我们团队的最新手稿中描述。使用Seurat R包中的Findmarkers功能计算不同簇之间的差异表达基因（DEGs）。使用CellChat R包分析成纤维细胞与癌细胞之间的细胞相互作用。

2.3 细胞培养和转染

A549和HFL1细胞从中国国家认证细胞库获得。A549细胞在RPMI 1640培养基中培养，HFL1细胞在DMEM-F12培养基中培养。两种培养基均添加了10%的胎牛血清（FBS）和青霉素链霉素（Gibco，美国），培养条件为37°C、5% CO2气氛。使用Lipofectamine 2000试剂（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商的说明对HFL1细胞进行COL1A1或COL1A2的siRNA转染。

2.4 共培养系统

A549细胞接种在六孔板上，而HFL1细胞以1.5×10^5细胞/mL的密度培养在Transwell插片的0.4毫米聚酯膜上（Corning，纽约，美国）。24小时后，将Transwell插件移动到包含A549细胞的六孔板上，这两种细胞以1:1的比例共培养。分别收集细胞和上清液以进行进一步分析。

2.5 定量实时聚合酶链反应

使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）从每个样本中提取1 μg的总RNA。使用Applied Biosystems聚合酶链反应（PCR）系统（Thermo Fisher Scientific，美国）和Reverse Transcription System（Takara Bio，日本）制备cDNA。使用SYBR Premix（Takara Bio，日本）在Roche LightCycler PCR系统上通过定量实时PCR测量相对mRNA表达水平。

2.6 细胞增殖实验

使用CCK8试剂（Keygen Biotech，中国）评估A549的增殖能力。共培养后，A549细胞以1×10^4细胞/孔的密度接种在96孔板上，培养24小时。将CCK8试剂与RPMI 1640培养基以1:10的比例混合后加入孔中，然后在37°C下孵育2小时。使用微孔板读取器在450 nm处测量吸光度。

2.7 伤口闭合实验

通过伤口闭合实验分析A549的迁移能力。A549细胞接种在六孔板上，培养至80%汇合。使用200 μL无菌移液器尖端在孔中心制造一个伤口。共培养48小时后，在光学显微镜（Olympus Corporation；放大倍数，×100）下观察细胞迁移。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）捕获图像，并量化伤口宽度（μm）。伤口闭合率按以下公式计算：(0小时时的宽度 - 48小时时的宽度) / 0小时时的宽度 × 100(%)。

2.8 侵袭实验

将A549细胞以5×10^4细胞/孔的密度接种在Transwell腔室（Corning Incorporated，美国）的上层腔室中，其中含有涂有Matrigel（BD Biosciences，美国）溶液的聚碳酸酯膜（24孔；孔径，8 μm）。下层腔室加入700 μL RPMI 1640培养基，其中添加了20%的FBS作为化学吸引剂。培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤上层腔室中的A549细胞两次，在室温下用4%的戊二醛固定6分钟，然后用Giemsa染色试剂（Sigma，美国）染色10分钟。在显微镜（Olympus Corporation；放大倍数，×200）下观察迁移或侵袭的细胞数量。使用ImageJ软件分析细胞计数，并计算处理组相对于对照组的倍数变化。

2.9 胶原蛋白I的ELISA实验

使用human ColI试剂盒（Abmart，上海）根据制造商的说明测量上清液中的胶原蛋白I水平。简要来说，收集细胞上清液并以1000 g离心20分钟以去除剩余的沉淀物。向预先涂有捕获抗体的板中加入50 μL样品或不同浓度的标准胶原蛋白I，然后加入HRP连接的检测抗体。在37°C下孵育60分钟后，洗涤板，并加入四甲基苯二胺底物溶液15分钟。通过加入停止溶液终止反应，在450 nm处使用微孔板读取器读取OD值。根据标准的OD值处理线性拟合，并计算胶原蛋白I的浓度。

2.10 统计分析

所有细胞实验数据均以平均值±标准误差的形式呈现。每个实验至少包含六个重复样本。使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software，美国）进行数据统计分析。在每次比较之前进行正态性测试。使用Student's t-test或Mann-Whitney U-test比较两组，而多组比较则使用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H-test。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 LUAD中细胞类型和基因表达的空间异质性

我们从五位因早期LUAD接受肺切除术的患者中收集了13个肺样本，包括六个正常组织、五个肿瘤组织和两个肿瘤周围组织。经过苏木精和伊红（H&E）染色和质量控制分析（图S1A）后，我们选择了四个肿瘤组织进行空间转录组学分析（图1A）。我们绘制了与缺氧、血管生成、上皮-间质转化（EMT）、糖酵解、氧化磷酸化（OXPHOS）和MYC通路相关的基因表达图谱，并揭示了分子的空间异质性（图1B–G）。与糖酵解相比，OXPHOS在肺腺癌中似乎更为活跃。与OXPHOS和MYC通路相关的基因表达显示出类似的分布，表明它们在LUAD代谢中起着重要作用。

3.2 LUAD中肿瘤-成纤维细胞的共定位模式

我们对一个选定的肿瘤组织样本进行了详细的细胞亚型分析（图2A）。通过聚类分析，在LUAD组织中发现了10个簇，包括一个巨噬细胞簇、四个成纤维细胞簇和五个上皮细胞簇（图2B、图S1B、C和表S1）。在上皮细胞簇（图S1D）中，C1主要表达SFTPC、SFTPB和SFTPA1，这些基因在正常肺上皮中占主导；C5表达KRT18、KRT8和CLDN1，这些基因是基底细胞的标志物，与肿瘤侵袭、转移和不良预后密切相关；C9表达编码Club细胞secret globin的基因。霍尔马克基因集分析显示C1和C5之间存在相反的生物学特征（图2C）。两种转录状态TS1和TS2被认为代表了肺癌中不同的肿瘤细胞特征。16 TS1相关的基因与正常上皮功能有关，而TS2相关的基因则显示出明确的肿瘤定向特征，如侵袭性细胞运动以及异常的增殖或凋亡。C5表现出更高的TS2活性，表明其具有更恶性的行为。图2

肺癌中细胞组成的异质性。我们通过对肺癌（LUAD）组织进行了空间转录组学分析，并将细胞进行了聚类，包括巨噬细胞、四个成纤维细胞簇、两个AT2簇、一个俱乐部细胞簇以及两个上皮细胞簇（A和B）。图C显示了C1和C5之间差异表达基因（DEGs）的热图。组织切片经过H&E染色后，我们将所有细胞簇进行了标记（D）。我们标出了高度恶性区域（红色方块）和低恶性区域（蓝色方块）。C1主要分布在低恶性区域，而C5则分布在高度恶性区域。基于点距离的分析（E）和典型相关性分析（F）表明C1和C4以及C0和C5之间存在密切关系。对于成纤维细胞簇（图S1E），C0表达POSTN、THY1、BGN和COL1A1，而C4表达A2M、DCN和C7。C8由TAGLN、ACTA2和MYL9标记，被注释为促进组织重塑和血管生成的肌成纤维细胞。接下来，我们根据H&E染色将两个区域指定为高度恶性和低恶性区域（图2D）。结果显示，低恶性区域富含C1和C4，而高度恶性区域富含C5和C0。为了进一步研究这些不同区域中的四个簇之间的关系，我们进行了典型相关性和基于点距离的分析，展示了C1和C4以及C5和C0的共定位（图2E,F）。从空间转录组学分析中，我们发现了两种不同的成纤维细胞-癌细胞交流模式，这些模式促进了肿瘤的恶性发展。

3.3 肺癌中的COL+成纤维细胞是CAFs

我们进一步分析了公共数据库中的四个簇（C0、C1、C4和C5）。从GSE136831、GSE128169、GSE128033、GSE131907_Lung_Cancer、E-MTAB-6653和E-MTAB-6149中获取了49名健康对照组（NOR）和24名LUAD患者的scRNA-seq数据。我们的分析显示，与正常组织相比，C0在肿瘤组织中的丰度显著更高（18.88% vs. 1.05%，p < 0.001，图3A）。成纤维细胞的tSNE也表明，C0在正常组织中很少见，但在LUAD组织中普遍存在（图3B,C）。根据在线细胞标记数据库，17 C0被注释为CAFs（图3D）。我们还在其他数据库中搜索了C0和C4，包括49名健康对照组（NOR）的肺组织样本、7名癌旁组织（PC_NOR）患者、18名慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者、40名特发性肺纤维化（IPF）患者、8名系统性硬化症（SSC）患者、24名LUAD患者以及来自不同 organs 的36个疾病样本。18 这表明C0在小肠（克罗恩病回肠炎）、皮肤（特应性湿疹）、眼睛和肺中最为常见（图4和图S2）。在肺疾病数据库中，C0在LUAD、IPF和SSC中更为丰富。另一方面，C4存在于所有肺疾病中，表明C4倾向于与肺中的正常成纤维细胞聚集（图S2B）。大量流行病学和临床研究证实，间质性肺疾病是肺癌的独立风险因素。基于我们的研究，推测C0成纤维细胞可能在这个过程中起着关键作用。图3

我们对公共数据集中的亚簇进行了深入分析。我们在49个正常肺组织和24个肺腺癌（LUAD）组织的scRNA-Seq公共数据集中检测到了C0、C1、C4和C5簇（A）。成纤维细胞的tSNE显示了C0和C4簇在正常肺组织和LUAD中的分布（B, C）。我们在在线数据集中搜索了C0的细胞标记，它们被注释为癌相关成纤维细胞（D）。*p<0.05, ****p<0.001。图4

我们还在不同的肺疾病中搜索了C0，包括健康对照组（NOR）、癌旁组织（PC_NOR）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者、特发性肺纤维化（IPF）、系统性硬化症（SSC）、肺腺癌（LUAD）以及36种不同器官的疾病。

3.4 LUAD和正常肺组织中C0的基因表达分析

空间转录组学分析显示，C0高度表达COL1A1、COL3A1、COL1A2等，而C4高度表达A2M、DCN、C7等（图5A）。为了探讨这些成纤维细胞亚型在LUAD患者中的预后意义，我们使用了癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行生存分析。LUAD患者根据C0或C4的前10个基因被分为两组。C0的高度表达基因与较差的预后密切相关，而C4的基因则没有影响（图5B,C）。我们进一步分析了C1和C5的基因表达和生存分析（图S3）。C5的高度表达基因促进了较差的预后。京都基因与基因组百科全书（KEGG）对C0和C4之间差异表达基因（DEGs）的通路分析表明，这些DEGs主要与蛋白质消化和吸收、细胞外基质（ECM）-受体相互作用、局部黏附等有关。基因本体论（GO）分析显示了ECM组织（生物过程[BP]）、细胞外区域（细胞成分[CC]和ECM结构成分（分子功能[MF]）的差异（图5D,E）。然后我们分析了C0与LUAD数据库中所有其他成纤维细胞之间的DEGs（表S2）。GO分析显示“胶原纤维组织”在所有通路中排名第三（图S4A）。KEGG强调了“ECM受体相互作用”在病理过程中的作用（图S4B）。生物信息学分析表明，C0成纤维细胞可能促进LUAD的发展，其潜在机制可能与肿瘤微环境（TME）中的ECM有关。图5

我们分析了C0和C4之间差异表达基因（DEGs）的情况。图A显示了空间转录组学中C0和C4之间的DEGs热图。我们使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行了生存分析（B, C）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析（D）和基因本体论（GO）分析（E）显示了与细胞外基质相关的潜在机制。

3.5 C0成纤维细胞与癌细胞之间的细胞交流

我们进一步分析了这四个细胞簇（C0、C1、C4和C5）之间的细胞交流。图6A和图6B分别显示了权重系数和配体-受体对的数量。数据表明，C0或C4成纤维细胞都可以与癌细胞建立交流。具体来说，成纤维细胞（C0和C4）与癌细胞（C1和C5）之间的交流主要通过成纤维细胞在ECM中分泌的物质实现，包括纤维连接蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等（图6C）。专注于C0和C5之间的配体-受体对（图6D），我们观察到与胶原蛋白和纤维连接蛋白相关的配体在成纤维细胞与癌细胞之间的交流中起重要作用。成纤维细胞分泌多种类型的胶原蛋白和纤维连接蛋白1，这些物质可以与癌细胞上的受体结合，包括CD44、SDC1、SDC4和整合素家族。值得注意的是，C5细胞表达了丰富的受体，使得与配体的结合更加牢固。此外，periostin-整合素和semaphorin 5-plexin A对在C0-C5交流中具有特异性，这些配对可能在LUAD的发展中起重要作用。图6

肺癌（LUAD）中癌细胞与成纤维细胞之间的相互作用。图A显示了C0、C1、C4和C5之间的权重系数（A）和配体-受体对的数量（B）。列出了所有的配体-受体，并用红色方块突出显示了C0和C5之间的交流（C）。我们详细列出了四类ECM-受体对，包括胶原蛋白、FN1、periostin和SEMA5信号通路（D）。

3.6 与肺癌细胞共培养的成纤维细胞可以分化为CAFs并支持肿瘤生长

我们之前已经得出结论，两种肿瘤-成纤维细胞共存的模式促进了LUAD的表型，包括增殖、迁移和侵袭。为了探索介导肺癌细胞（A549）和成纤维细胞（HFL1）之间相互作用的胶原相关通路，我们开发了A549和HFL1的共培养系统（图7A）。HFL1中的COL1A1和COL1A2表达水平显著升高，这与空间转录组学中C0的结果一致，表明其具有高恶性（图7B,C）。此外，在与A549共培养的HFL1中检测到了TGFB1、PDGFA、PDGFB和FSP的高表达（图7D），表明与肺癌细胞共培养的成纤维细胞分化为CAFs，这些CAFs积极支持肿瘤生长。进一步分析A549的增殖（图7E,F）、EMT（图7G）、血管生成（图7H）、侵袭（图7I）和迁移（图7J）表明，与成纤维细胞共培养的肺癌细胞可以具有更高的恶性程度。图7

A549和HFL1的共培养系统。体外实验的一般流程如图（A）所示。HFL1与A549共培养时高度表达了COL1A1（B）、COL1A2（C）以及与癌相关成纤维细胞CAFs相关的标志物（D）。CCK8检测（E）和Ki67的表达（F）代表了共培养A549的细胞增殖。E-钙黏蛋白和vimentin的mRNA表达代表了上皮-间质转化（G），而VEGFα和MMP3的mRNA表达代表了血管生成（H）。Transwell室用于评估细胞侵袭（I）。伤口闭合检测用于评估细胞迁移（J）。*p<0.05, **p<0.01, n = 6。

3.7 CAFs通过COL1A1/COL1A2编码的胶原蛋白促进肿瘤生长

COL1A1和COL1A2编码胶原蛋白I，成纤维细胞可以将其分泌到细胞外空间。我们在六个肺疾病的公共数据集中进一步计算了COL1A1和COL1A2的表达情况。肺组织中的成纤维细胞被注释并分为成纤维细胞、肌成纤维细胞、脂肪成纤维细胞和纤维肌细胞。结果显示，COL1A1和COL1A2在LUAD、IPF和SSC中的成纤维细胞和纤维肌细胞中的表达显著升高（图8）。在HFL1中敲低COL1A1或COL1A2显著降低了胶原蛋白I的表达（图9A,B）。A549与HFL1共培养后，上清液中的胶原蛋白I表达升高（图9B）。在HFL1中敲低COL1A1或COL1A2抑制了A549的增殖（图9C）、侵袭（图9E）和迁移（图9F）。对于EMT，敲低COL1A2对E-钙黏蛋白和vimentin的表达影响更为明显（图9G）。然而，敲低COL1A1或COL1A2对血管生成的影响较小（图9H）。这表明成纤维细胞分泌的胶原蛋白I在支持肿瘤生长中起着关键作用，这可能是CAFs在TME中的潜在机制之一。图8

我们在六个肺疾病中所有类型的成纤维细胞中分析了COL1A1/COL1A2的基因表达。成纤维细胞被分为四种亚型，包括肌成纤维细胞、脂肪成纤维细胞、纤维肌细胞和经典成纤维细胞（Fibroblast）。****p<0.0001。图9

在HFL1中敲低COL1A1/COL1A2对A549的影响。体外实验的一般流程如图（A）所示。HFL1被分为四组，包括对照组、与A549共培养组、COL1A1敲低组、COL1A2敲低组，以及通过ELISA检测细胞上清液中的胶原蛋白I（B）。CCK8检测（C）和Ki67的表达（D）代表了与HFL1共培养的A549的细胞增殖。Transwell室用于评估细胞侵袭（E）。伤口闭合检测用于评估细胞迁移（F）。E-钙黏蛋白和vimentin的mRNA表达代表了上皮-间质转化（G），而VEGFα和MMP3的mRNA表达代表了血管生成（H）。*p<0.05, **p<0.01, n = 6。

4 讨论

在这项研究中，我们对LUAD的肺组织样本进行了空间转录组学分析，发现每个样本中都存在空间异质性。不同区域的细胞亚型和基因表达各不相同。我们识别出了成纤维细胞与肺癌细胞之间的位置关系，其中SPP1+ TM4SF4+上皮细胞（C5）和COL+成纤维细胞（C0）在LUAD的高度恶性区域共存，并通过多种配体-受体对进行交流。此外，我们强调了细胞模型中与胶原蛋白I相关的交流。与A549共培养的成纤维细胞分化为CAFs，其特征是胶原蛋白I的分泌增加。这种胶原蛋白I随后促进了癌细胞的增殖、血管生成、EMT和侵袭。这些发现表明，肺癌细胞也可以促进成纤维细胞分化为CAFs，并创造适合其生存的微环境（图10）。图10：在PowerPoint图示工具中打开

肺腺癌（LUAD）中癌细胞与成纤维细胞之间的两种共定位模式。SPP1+ TM4SF4+上皮细胞和COL+成纤维细胞共位于高度恶性区域，而SFTPC+上皮细胞和DCN+成纤维细胞则位于低恶性区域。COL+成纤维细胞被标记为癌相关成纤维细胞，这些细胞表达TGFβ1、PDFGα、PDFGβ和FSP。CAF（癌相关成纤维细胞）能够分泌胶原蛋白I，促进肿瘤的侵袭、增殖、上皮间质转化（EMT）、血管生成和迁移。肿瘤微环境（TME）包含多种细胞类型，包括免疫细胞、血管细胞和基质细胞，它们在肿瘤生长中起着关键作用。空间转录组学是一种强大的工具，可以同时捕捉TME内的详细遗传变化和位置关系，主要应用于肺癌的免疫细胞研究。19, 20 我们的研究将空间转录组学方法扩展到了LUAD中的成纤维细胞，揭示了遗传异质性和细胞的空间分布。通过分析分子异质性，我们发现在不同区域中OXPHOS和MYC通路存在一致的遗传改变。MYC通常被认为是一种原癌基因，是癌症代谢重编程的主要调节因子，能够刺激糖酵解、核苷酸生物合成和谷氨酰胺利用。最近对几种癌症的研究表明，代谢从OXPHOS转向糖酵解，导致TME的抑制作用增强。21 有趣的是，我们的发现似乎与这一观点相反。另一项研究也表明，由线粒体诱导的氧化代谢可以在肿瘤发生过程中驱动神经干细胞的永生化，22 这进一步扩展了我们对肿瘤代谢的理解。尚需进一步研究以确定这种代谢过程是否在LUAD中发生，以及代谢异质性是否会影响不同的预后。我们的研究还揭示了成纤维细胞与癌细胞之间的细胞通讯。我们首先发现，不同恶性区域的癌细胞伴随着不同的成纤维细胞，其中一些成纤维细胞表达CAF标志物，如PDGFRα、TGFβ、FSP等。这些成纤维细胞高表达COL1A1/COL1A2，编码胶原蛋白I。相比之下，低恶性区域的成纤维细胞高度表达A2M，编码α2-巨球蛋白，后者在正常上皮组织中也有存在。23 基于这些结果，我们认为成纤维细胞在LUAD的TME中可能具有重要作用。在后续关于癌细胞与成纤维细胞之间通讯的研究中，我们发现胶原蛋白I和纤维连接蛋白1相关的配体-受体对普遍表达。这些ECM-受体相互作用被认定为多种癌症（包括LUAD）的诊断和治疗靶点。24 此外，semaphorin（SEMA）5-PLXNA通路在C0和C5组的相互作用中具有特异性。最近的研究表明，这一通路与癌症患者的预后和免疫治疗反应有关。25 M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）衍生的SEMA5A与癌细胞表达的PLXNB3结合，从而促进肿瘤进展。26 然而，在LUAD中，多项研究表明SEMA5A在癌细胞上的表达具有相反的作用——作为肿瘤抑制因子，27, 28 与其他癌症的结果相反。关于细胞外SEMA5A对肺上皮细胞的影响及其在癌细胞与成纤维细胞相互作用中的贡献尚未得到充分研究。在我们的研究中，伴随高度恶性癌细胞的成纤维细胞中胶原蛋白I高度表达。最近的研究将COL1A1和COL1A2确定为识别大多数LUAD数据集中CAF亚群的有效标志物。29 据报道，COL1A1/COL1A2在多种肿瘤组织中也上调，促进肿瘤增殖、转移、血管生成和癌细胞干性，这些都被列为潜在的治疗靶点。30 Kaplan-Meier分析显示COL1A1的表达与肺癌患者的生存时间呈负相关。31 最近的研究从非小细胞肺癌患者中分离出了CAF，并报告了COL1A1的高表达。32 在我们的研究中，我们验证了CAF能够分泌胶原蛋白I，这主要促进了肿瘤的增殖和转移，而不是上皮间质转化或血管生成，表明某些肿瘤表型需要更广泛的CAF分泌组。这一发现与其他癌症的研究结果相反，33 表明胶原蛋白I的作用可能具有癌症类型特异性。关于其潜在机制，有研究表明胶原蛋白I可以通过TGFβ3通路诱导上皮间质转化。34 在携带EGFR突变的LUAD患者中，胶原蛋白I可以通过激活EGFR突变癌细胞的mTOR信号通路来驱动酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。35 这表明胶原蛋白I可能在LUAD中调节广泛的生物学过程。总之，癌症治疗的治疗靶点可能会转向成纤维细胞，补充现有的针对免疫细胞或癌细胞的目标。我们的研究存在一些不可避免的局限性。首先，空间转录组学分析是基于单一个LUAD样本进行的，缺乏在其他样本中的进一步验证。由于患者的异质性（具有不同的病理特征或疾病阶段），需要在更多样化的临床样本和不同细胞系中进行研究，以确认我们的发现的普遍性。其次，我们的空间转录组学分析中的细胞聚类较为粗糙。为解决这一问题，结合单细胞转录组学技术可以帮助获得未来研究的综合分子图谱。最后，胶原蛋白I以及其他CAF与癌细胞间相互作用中的配体-受体对的潜在机制尚未深入探讨，它们对不同生物学过程的影响需要在后续研究中进一步探索。虽然CellChat能够有效识别潜在的配体-受体对，但在解读空间转录组学数据时应考虑这种预测方法的局限性。分析基于来自混合细胞群体的空间点基因表达，因此推断的成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用仅表明可能存在空间邻近的通讯网络，并非直接跨细胞信号传递的确定性证据。这些发现应被视为假设生成性的，需要实验验证。我们的研究表明，成纤维细胞的空间分布与LUAD中癌细胞的生物学行为密切相关，这一发现与体外共培养系统的结果一致。针对LUAD患者中表达CAF表型的成纤维细胞可能具有潜在的治疗价值。我们推测，与癌细胞的共培养可以促使成纤维细胞分化为CAF，并进而刺激胶原蛋白I的分泌。因此，胶原蛋白I在介导CAF与癌细胞之间的通讯中起着关键作用，可能是一个潜在的治疗靶点。

作者贡献：
宋远林、吴窦桥和陈敖参与了工作的概念和设计；李立阳、刘晓霞、刘一飞、刘轩琦、江玉佳、陈健、陈刚和陈天翔参与了数据的获取、分析或解释；李立阳和宋东丽起草并修订了论文。

致谢：
本工作得到了国家自然科学基金（82300048）和中国博士后科学基金（2023M730661）的支持。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

伦理声明：
所有患者均已签署知情同意书，同意组织样本和临床数据的收集，该同意书得到了复旦大学中山医院伦理委员会的批准（许可编号B2021-265）。

数据可用性声明：
由于伦理限制，支持本研究结果的数据不公开提供，如有需要，可向通讯作者请求获取。