DRAM1调控的自噬-JAK-STAT-Tregs轴驱动免疫抑制，并可预测泛癌患者对免疫治疗的反应

《Clinical and Translational Discovery》：DRAM1-defined autophagy-JAK-STAT-Tregs axis drives immunosuppression and predicts immunotherapy response in pan-cancer

　　**摘要**

**背景**
DNA损伤调节的自噬调节因子1（DRAM1）是一种参与自噬调控的溶酶体蛋白，然而其在人类癌症中的全面作用，尤其是在TIME（肿瘤免疫微环境）中的作用，仍然缺乏系统的研究。

**方法**
我们利用TCGA、GTEx等平台的多组学数据，对33种恶性肿瘤中的DRAM1进行了全面的癌症分析。我们的方法包括表达谱分析、生存分析、基因组和表观遗传学特征描述、功能富集、免疫细胞浸润评估以及治疗反应预测。通过A549细胞中的DRAM1敲低实验验证了DRAM1-JAK-STAT轴的作用，并通过Western blot检测了STAT3的磷酸化情况。

**结果**
DRAM1在多种癌症中表现出广泛的失调现象，并具有显著的预后相关性：在UCEC（尿路上皮癌）中表现为有利因素（HR = 0.34），但在PDAC（胰腺导管腺癌）中则表现为不利因素（HR = 1.90）。我们确认了DRAM1在自噬网络中的核心位置，并发现其与免疫抑制轴有显著关联，该轴连接了IFN-γ信号传导、JAK-STAT激活和Tregs（调节性T细胞）的招募，这一关联得到了IFNG（ρ = 0.742在DLBC中）、JAK1、STAT3以及Tregs标记物（FOXP3和CTLA4）的强相关性支持。实验进一步证实，A549细胞中DRAM1的敲低会减弱STAT3的磷酸化。DRAM1的表达与多种免疫检查点分子相关，并预测了对多种化疗药物的耐药性。重要的是，DRAM1在多个队列中显示出对免疫治疗反应的显著预测价值，其在胃癌中的AUC为0.742。

**结论**
我们的研究表明，DRAM1是一个依赖于背景的肿瘤免疫微环境调节因子，其与IFN-γ/JAK-STAT/Tregs免疫抑制轴有关。这些发现使DRAM1成为预测免疫治疗反应的有希望的生物标志物，并提示其可能成为联合免疫治疗策略的目标。

**1 引言**
癌症仍然是一个重大的全球健康挑战，据估计2023年有1040万人因此死亡，2.71亿人的生命年因癌症而受损。免疫疗法，特别是免疫检查点阻断（ICBs），通过利用宿主免疫系统来对抗肿瘤，彻底改变了肿瘤学，使得黑色素瘤和肺癌等癌症的死亡率下降。然而，ICBs的有效性主要体现在“热”（T细胞炎症）肿瘤中，而“冷”（非T细胞炎症）肿瘤（其特征是缺乏CD8+ T细胞浸润以及大量免疫抑制细胞，如调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））则构成了主要的治疗障碍。肿瘤微环境（TME）中这些免疫抑制细胞的功能障碍是导致免疫疗法不敏感的关键因素。这些调节性细胞在肿瘤内的积累与患者预后不良密切相关，并严重阻碍了癌症免疫疗法的效果。

DRAM1在33种癌症中普遍失调，并具有依赖于背景的预后意义。DRAM1与一个免疫抑制性的IFN-γ/JAK-STAT/Tregs网络相关，该网络形成了“冷”肿瘤微环境。实验验证表明，DRAM1的敲低会减弱STAT3的磷酸化，支持其在JAK-STAT信号传导中的作用。临床数据显示，DRAM1能够预测多个队列中的免疫治疗反应，突显了其作为生物标志物的价值。在这个复杂的背景下，自噬已成为肿瘤细胞生物学和抗肿瘤免疫之间的关键调节因子。自噬影响关键的免疫过程，包括抗原呈递、T细胞激活和细胞因子分泌，同时调节免疫抑制成分，如Treg功能和M2巨噬细胞的极化，从而在塑造肿瘤免疫微环境（TIME）中发挥多方面作用。自噬与免疫信号传导之间的相互作用是双向的；例如，IFN-γ能强烈诱导自噬，而免疫细胞内的自噬可以通过代谢途径限制其效应功能，这一点在CD8+ T细胞中经过核心自噬基因的基因敲除后得到了证实。此外，自噬已被证明是IFN-γ诱导的JAK2-STAT1信号传导和随后的炎症反应的关键促进因素。这种双重且依赖于背景的作用强调了自噬在塑造TIME中的复杂作用。自噬还通过促进MHC-I分子的溶酶体降解来促进“冷”表型的形成，从而降低肿瘤的免疫原性并损害CD8+ T细胞的识别能力。

肿瘤的复杂生态系统，其特征是巨大的肿瘤内和肿瘤间异质性，为耐药克隆的进化提供了基础，并对实现持久的治疗效果构成了根本性挑战。在这种背景下，DNA损伤调节的自噬调节因子1（DRAM1）已成为自噬流的关键调节因子，影响自噬体-溶酶体融合和溶酶体酸化。DRAM1最初被确定为p53的直接转录靶标，其表达还受到其他因素的调控，包括p53家族成员p73。因此，p53-DRAM1通路构成了基因组完整性监测与通过自噬维持蛋白质组稳态之间的关键联系。功能上，DRAM1的作用是多方面的且依赖于背景。先前的研究表明，DRAM1在肺腺癌（LUAD）中具有保护作用，高表达与良好的预后相关；机制研究揭示了它可以通过促进NSCLC中EGFR的溶酶体降解来发挥肿瘤抑制作用。相反，在胶质母细胞瘤干细胞中，它促进了细胞的运动性和侵袭性。除了癌症之外，DRAM1还位于先天免疫和自噬的交汇点，因为其在细菌感染时通过TLR-MYD88-NF-κB通路被诱导，并且对于通过选择性自噬限制病原体是必需的。这种功能上的双重性突显了一个关键问题：是什么决定了DRAM1在肿瘤免疫背景下的不同作用？新兴证据暗示了DRAM1的免疫调节潜力。它受到炎症细胞因子和先天免疫信号传导的诱导。在癌症中，DRAM1的表达在PD-1阻断下依赖于背景进行调控。然而，这些发现是零散的，仅限于个别癌症类型或特定的实验设置，缺乏系统的癌症范围视角。此外，对DRAM1在免疫信号传导途径中的功能验证仍然很少。缺乏系统的癌症范围研究来确定DRAM1是否一致地影响TIME，如果确实如此，是通过哪些特定的免疫轴。自噬、IFN-γ信号传导和JAK-STAT激活之间的已知相互作用表明，自噬促进了IFN-γ诱导的JAK2-STAT1信号传导，这为DRAM1提供了一个引人注目但尚未探索的机制联系。DRAM1是否是这一信号网络的组成部分，并且是否有助于招募和调节关键免疫抑制细胞（如Tregs）？为了解决这些关键问题，我们对33种癌症类型的DRAM1进行了全面的癌症分析。我们利用整合的多组学数据系统地：（1）描绘了其癌症范围内的表达和预后情况；（2）描述了其基因组和表观遗传学调控；（3）验证了其在自噬网络中的核心功能；（4）阐明了其在免疫细胞浸润中的依赖于背景的作用及其与IFN-γ/JAK-STAT/Tregs轴的潜在关联；（5）通过敲低实验验证了DRAM1与JAK-STAT信号传导之间的功能联系；（6）评估了其对化疗药物敏感性和免疫治疗反应的预测价值。我们的研究表明，DRAM1不仅是一个自噬调节因子，还是肿瘤免疫景观的一个关键、依赖于背景的相关因素，其功能与特定的免疫抑制途径密切相关，从而为理解其在癌症生物学和治疗中的双重作用提供了系统框架。

**2 方法和材料**

**2.1 表达分析**
使用GENT2数据库（http://gent2.appex.kr/）基于GPL570平台（HG-U133_Plus_2）分析了人类组织中的DRAM1 mRNA表达谱，该平台汇集了来自72种正常和肿瘤组织的超过68,000个样本。平台使用p < 0.05的显著性阈值评估了肿瘤组织和正常组织之间的差异表达，并使用log2倍变化（log2FC）量化了变化幅度。为了验证和扩展这些发现，我们使用了TIMER3网络工具（https://compbio.cn/timer3/）来检查TCGA中21种常见癌症类型的DRAM1表达，其中表达水平是使用edgeR基于RNA-Seq原始计数计算的。此外，还使用了GEPIA3在线平台（https://gepia3.bioinfoliu.com/）将TCGA数据与GTEx数据整合，以便在更广泛的恶性肿瘤中进行更稳健的比较，使用|log2FC|的截止值为1.0和q值阈值0.05。

**2.2 生存分析**
使用Kaplan–Meier绘图器数据库（https://kmplot.com/analysis/）评估了DRAM1表达对总生存期（OS）的预后价值，这是一个公开可用的资源，可用于分析来自21种肿瘤类型的超过40,000个样本的生存数据，涵盖超过355万患者。患者群体根据评估下四分位数和上四分位数之间的所有可能值，被分为高DRAM1表达组和低DRAM1表达组。该平台生成了Kaplan–Meier生存图，并使用log-rank测试评估显著性，同时对多重测试进行了FDR调整。通过Cox回归估计了关联的强度，提供了HR及其相应的95%置信区间（CI）。

**2.3 基因组和表观遗传学分析**
利用GSCA平台（https://guolab.wchscu.cn/GSCA/）的多组学数据研究了DRAM1基因的基因组和表观基因组改变。GSCA汇集了来自33种TCGA癌症类型的超过10,000个多维基因组样本，以及来自GDSC和CTRP的750多种小分子药物，该平台专为基因组学、药物基因组学和免疫基因组学分析而设计。本研究使用了来自TCGA的mRNA表达、CNV、DNA甲基化和SNV数据，这些数据通过UCSC Xena和Synapse获得。分析包括体细胞突变、SNV和DNA甲基化。在GSCA内的所有分析中，使用p值和FDR确定统计显著性，FDR < 0.05被视为显著。具体来说，使用log-rank测试和Cox比例风险模型评估了与患者生存（OS、PFS、DSS和DFI）的关联。使用Spearman的等级分析评估了相关性（例如，CNV与mRNA表达之间或甲基化与表达之间的相关性）。使用双样本t检验识别了差异甲基化的探针。

**2.4 功能富集和网络分析**
使用STRING数据库（https://string-db.org/；版本12.0，涵盖12,535个生物体、5930万个蛋白质和截至2023年7月的超过200亿个相互作用）进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和功能富集分析，该数据库系统地收集和整合了来自多个来源的PPI，包括文献挖掘、计算预测、实验数据库和策划的途径资源。构建PPI网络时设置了0.7的高置信度相互作用阈值。使用FDR < 0.05作为富集术语的显著性截止值进行了GO和KEGG途径富集分析。

**2.5 免疫细胞浸润和免疫调节剂分析**
使用TIMER3数据库（https://compbio.cn/timer3/）的多种计算反卷积算法（CIBERSORT、EPIC、MCP-COUNTER、QUANTISEQ、XCELL、TIMER）估计了33种TCGA癌症类型的免疫细胞浸润水平。使用部分Spearman的ρ值（考虑了肿瘤纯度调整）评估了DRAM1表达与免疫细胞浸润分数之间的关联，除了EPIC和QUANTISEQ，因为这些情况下细胞分数与纯度呈负相关。使用TISIDB数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB/）研究了DRAM1表达与免疫调节剂之间的相关性，该数据库整合了手动策划的文献记录和30种TCGA癌症类型之间基因和免疫特征之间的预计算关联。使用TIMER3中的转录组数据分析了与一组重点免疫相关基因（IFNG、JAK1、STAT3、FOXP3、CTLA4、CD274、HAVCR2和TIGIT）的相关性。TISIDB和TIMER3平台都应用了Spearman的ρ分析，并使用FDR方法对多重测试进行了p值调整。

**2.6 药物敏感性和免疫治疗反应分析**
使用GSCA平台（https://guolab.wchscu.cn/GSCA/）的GDSC和CTRP数据库数据研究了DRAM1表达与药物敏感性（半数最大抑制浓度IC50）之间的关联，该平台整合了超过750种小分子药物。平台使用了Spearman的ρ分析，FDR < 0.05被视为显著。使用TIMER3可访问的多个独立队列的公开转录组数据集评估了DRAM1在免疫治疗反应中的预测价值，这些数据集整合了32个与免疫治疗相关的公共RNA-seq数据集。使用log2FC和p值评估了响应者和非响应者之间的DRAM1表达差异。使用ROC分析评估了预测性能，计算了AUC。

**2.7 细胞培养、siRNA敲低和Western blot**
从中国科学院细胞库获得了A549人肺腺癌细胞。细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，处于5% CO2的湿润气氛下，温度为37°C。细胞以每孔3 × 10^5个细胞的密度接种在6孔板中，并培养24小时后进行转染以实现DRAM1敲低。Hanheng Biotechnology合成了三种针对DRAM1的独立小干扰RNA（siRNA）序列（hsa-DRAM1-si-1、hsa-DRAM1-si-2、hsa-DRAM1-si-3）和一个阴性对照siRNA（siNC，序列列在表S1中）。按照制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）将100 nM的siRNA转染到细胞中。转染后48小时收获细胞进行Western blot分析，通过Western blot验证了敲低效率。对于Western blot分析，细胞以每孔1.5 × 10^6个细胞的密度接种在6孔板中，并进行了指定的处理。总蛋白使用RIPA缓冲液提取，每个样本提取20–30 μg，然后通过10% SDS-PAGE分离，并电转移到PVDF膜上（Bio-Rad）。膜用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4°C下过夜孵育，加入针对DRAM1（1:1000，Thermo Fisher Scientific）、STAT3（1:1000，Starter-Bio）、磷酸化STAT3（Tyr705，1:1000，Starter-Bio）和GAPDH（1:5000，Starter-Bio）的一抗。洗涤后，膜在室温下与二抗孵育2小时。使用增强型化学发光（ECL）底物（Bio-Rad）显影。

2.8 统计分析

本研究中呈现的所有分析和可视化结果均通过引用的在线生物信息学平台进行，这些平台具有内置的统计模块，具体细节见各自的方法部分。双侧p值<.05被用作统计显著性的阈值；对于多重比较，使用FDR方法调整p值，FDR<.05被视为显著。对于体外实验，数据以三个独立生物重复实验的平均值±标准差（SD）表示。NC组与每个siRNA处理组之间的比较使用双尾Student's t检验进行分析，p<.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 DRAM1的泛癌表达谱

对GENT2数据库的分析显示，DRAM1在大多数检查的组织中表达显著失调（图1A）。它在脑（log2FC = 1.091）、结肠（log2FC = 0.965）、睾丸（log2FC = 1.781）、甲状腺（log2FC = 1.167）和子宫（log2FC = 0.923）中显著上调，而在肾上腺（log2FC = ?0.666）、肺（log2FC = ?0.637）和乳腺（log2FC = ?0.162）中显著下调。通过TIMER3对TCGA数据的分析确认了18种常见癌症中DRAM1的显著失调（图1B）。DRAM1在CHOL、COAD、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、READ、STAD和THCA中的表达显著升高，但在BRCA、KICH、LUAD、LUSC、PAAD、PCPG、PRAD和UCEC中显著降低。此外，原发性SKCM肿瘤中的DRAM1表达明显低于转移性病变。使用GEPIA3整合TCGA和GTEx数据进一步确认了DRAM1在DLBC、GBM、LAML、LGG和SKCM中的显著上调，在UCS中显著下调（图1C）。总体而言，这些结果描绘了DRAM1在人类癌症中的特征性表达模式，显示在消化系统癌症（COAD、READ、STAD、LIHC、CHOL）中一致上调，在腺体和内分泌相关恶性肿瘤（BRCA、PRAD、PAAD、UCEC）中主要下调。

3.2 DRAM1在癌症中的预后意义

为了评估DRAM1的泛癌预后意义，我们使用Kaplan–Meier绘图数据库进行了一系列分析（图2A–H）。高DRAM1表达与UCEC（图2A）、骨髓瘤（图2B）、LUAD（图2C）、HNSC（图2D）、乳腺癌（图S1A）、胃癌（图S1B）、卵巢癌（图S1C）、KIRC（图S1D）和SARC（图2E）中的生存期延长显著相关。相反，高DRAM1表达与PDAC（图2F）、LUSC（图2G）和LIHC（图2H）中的生存期缩短相关。值得注意的是，DRAM1在不同亚型的肺癌中表现出相反的预后作用，在LUAD中作为保护因素，而在LUSC中作为风险因素。

3.3 DRAM1的基因组和表观遗传调控

我们进行了综合分析，以表征DRAM1在各种癌症中的基因组和表观基因组特征（图3）。SNV分析显示，UCEC、STAD和SKCM中的DRAM1突变率最高（分别为1.51%、1.14%和1.07%）（图3A）。STAD中DRAM1突变状态与较差的无病间隔显著相关（log-rank p = .000668，HR = 6.008）（图3B）。DRAM1的拷贝数改变，特别是杂合扩增，在ACC（70.00%）、TGCT（56.67%）和KIRP（39.24%）中普遍存在（图3C）。在几种癌症中观察到CNV与DRAM1 mRNA表达之间的显著正相关，包括KIRP（spm = .326，FDR = 4.88e-7）、LGG（spm = .369，FDR = 5.32e-16）和LIHC（spm = .303，FDR = 4.11e-8）（图3D）。CNV状态也与多种癌症患者的生存显著相关（图3E）。DNA甲基化分析显示，大多数癌症类型中DRAM1 mRNA表达与DNA甲基化显著负相关（图3F），表明其表达受到过度甲基化的抑制。差异甲基化分析在BRCA、ESCA、LUAD和PRAD的肿瘤组织中检测到显著的高甲基化，在KIRC、KIRP、LIHC和THCA中检测到显著的低甲基化（图3G）。生存分析揭示了特定甲基化探针的上下文依赖性预后关联（图3H–M）。

3.4 功能富集和网络分析

为了阐明DRAM1的功能背景，我们使用STRING数据库进行了PPI网络和富集分析（图4）。结果网络显示，DRAM1与一组自噬相关蛋白功能相关，包括ATG5、ATG7、ATG12、BECN1和UVRAG（图4A）。功能富集分析显示，自噬相关生物过程显著过表达，尤其是“线粒体自噬”（GO:0000422，FDR = 1.39e-11）、“自噬”（GO:0006914，FDR = 1.56e-11）、“自噬调节”（GO:0010506，FDR = 3.01e-11）和“巨自噬”（GO:0016236，FDR = 3.48e-11）（图4C）。细胞成分分析表明其强烈定位于自噬体结构（图4B）。KEGG通路分析进一步证实了这些发现，显示在“自噬—动物”（hsa04140，FDR = 1.52e-8）和“线粒体自噬—动物”（hsa04137，FDR = 4.70e-6）中的显著富集（图4D）。

3.5 全面免疫细胞浸润分析

我们使用TIMER3的多种反卷积算法系统评估了33种癌症类型中DRAM1表达与五种关键免疫细胞类型浸润水平之间的相关性（图5）。分析揭示了癌症类型特异性关联（图5A）。对于CD8+ T细胞，DRAM1表达在UVM（EPIC: ρ = 0.76）（图5B）和STAD（CTL_TIDE: ρ = 0.534）（图5C）中显示出强正相关，但在THYM（TIMER: ρ = -0.403）（图5D）中显示出显著负相关。DRAM1表达与巨噬细胞浸润呈正相关，特别是在TGCT（CONSENSUS_TME: ρ = 0.716）（图5E）、BRCA-Basal中的M1巨噬细胞（QUANTISEQ: ρ = 0.597）（图5F）和PAAD中的M2巨噬细胞（CIBERSORT-ABS: ρ = 0.579）（图5G）中。在TGCT（CONSENSUS_TME: ρ = 0.759）（图5H）、BRCA-Basal（CONSENSUS_TME: ρ = 0.598）（图5I）和THCA（ABIS: ρ = 0.614）（图5J）中观察到与中性粒细胞浸润的强正相关。树突状细胞浸润在LIHC（Plasmacytoid DC，ABIS: ρ = 0.665）（图5K）、COAD（Myeloid DC，TIMER: ρ = 0.619）（图5L）和LUSC（Myeloid DC，CONSENSUS_TME: ρ = 0.567）（图5M）中与DRAM1显著正相关。此外，DRAM1表达与HNSC-HPV+（CONSENSUS_TME: ρ = 0.599）（图5N）、COAD（QUANTISEQ: ρ = 0.508）（图5O）和PRAD（QUANTISEQ: ρ = 0.549）（图5P）中的Tregs浸润显著正相关（图5）。

3.6 DRAM1表达与多种免疫调节因子和特定的JAK-STAT/Tregs轴的相关性

为了全面描述DRAM1的免疫调节作用，我们系统分析了其与TCGA癌症类型中多种免疫调节因子的相关性（图6A–E）。DRAM1表达与许多免疫调节因子显示出显著的癌症类型特异性相关性。值得注意的是，它与关键免疫抑制检查点显示出强正相关，包括SKCM中的PD-L1（CD274；ρ = 0.611）（图6F）、SKCM中的PD-1（PDCD1；ρ = 0.534）（图6G）、OV中的TIM-3（HAVCR2；ρ = 0.698）（图6H）和SARC中的TIGIT（ρ = 0.548）（图6I）。图6显示了DRAM1与广泛免疫调节因子的相关性。

3.7 DRAM1表达预测药物敏感性和免疫治疗反应

GDSC数据集的分析（图8A）表明，DRAM1表达升高与对多种药物的敏感性相关，包括博莱霉素（50 μM，cor = -0.333）、17-AAG（cor = -0.294）、多西他赛（cor = -0.249）、达沙替尼（cor = -0.270）和曲美替尼（cor = -0.204）。相反，它与WZ3105（cor = 0.303）、伏立诺司他（cor = 0.232）、甲氨蝶呤（cor = 0.202）和纳维托克拉克（cor = 0.212）的耐药性相关。在CTRP数据集（图8B）中，DRAM1表达主要与药物耐药性相关，例如Panobinostat（cor = 0.334）、长春新碱（cor = 0.324）、BI-2536（cor = 0.321）、Belinostat（cor = 0.411）和多柔比星（cor = 0.213）。总体而言，这些发现确立了DRAM1作为传统化疗药物和靶向药物反应的上下文依赖性预测因子。

3.8 DRAM1表达预测药物敏感性和免疫治疗反应

GDSC数据集（图8A）的分析表明，DRAM1表达升高与多种药物的敏感性相关。红色和蓝色气泡分别代表正相关（耐药）和负相关（敏感）。气泡颜色强度对应于相关系数，大小与统计显著性成正比（-log10(FDR)）。黑色轮廓表示FDR ≤ .05。C–E中的小提琴图显示NSCLC_GSE126044（C）、Melanoma_PRJEB23709（D）和STAD_PRJEB25780（E）队列中响应者（R）与非响应者（NR）的DRAM1表达显著更高。F–J中的ROC曲线展示了DRAM1在STAD_PRJEB25780（F）、LGG_E_MTAB_6270（G）、NSCLC_GSE135222（H）、Melanoma_PRJEB23709（I）和Melanoma_Nathanson_2017（K）队列中免疫治疗反应的预测性能。与其在免疫调节中的潜在作用一致，并且与DRAM1在LUAD中的保护功能相符，差异表达分析显示，在NSCLC_GSE126044中，非响应者的DRAM1表达显著下调（log2FC = -0.581，p = .022）（图8C），这包括LUAD患者。在melanoma_PRJEB23709（log2FC = -0.466，p = .002）（图8D）和STAD_PRJEB25780（log2FC = -0.446，p = .013）（图8E）中也观察到了类似的关联。在独立的免疫治疗队列中，DRAM1显示出对特定癌症反应的显著预测能力，其AUC值分别为：STAD_PRJEB25780中的0.742（图8F）、LGG_E_MTAB_6270中的0.733（图8G）、NSCLC_GSE135222中的0.618（图8H）、Melanoma_PRJEB23709中的0.705（图8I）、Melanoma_GSE115821中的0.676（图8J）以及Melanoma_Nathanson_2017中的0.656（图8K）。这些结果表明，DRAM1是一个依赖于上下文的药物敏感性和免疫治疗反应的预测因子。

3.8 DRAM1-JAK-STAT轴的实验验证

为了功能上验证我们在生物信息学分析中发现的DRAM1与JAK-STAT信号通路之间的关联，我们在A549肺腺癌细胞中进行了siRNA介导的DRAM1敲低实验。转染三种独立的hsa-DRAM1特异性siRNA（hsa-DRAM1-si-1、hsa-DRAM1-si-2和hsa-DRAM1-si-3）后，DRAM1蛋白的表达量显著降低，与阴性对照siRNA相比（图9C）。Western blot分析显示，DRAM1敲低显著降低了STAT3在Tyr705位的磷酸化水平，而总STAT3表达量保持不变（图9A,B）。这些结果证明了DRAM1敲低可以减弱STAT3的磷酸化，为DRAM1与STAT3激活之间的调控关系提供了实验证据，这与我们在泛癌症分析中提出的DRAM1-JAK-STAT3轴一致。

4 讨论

在这项研究中，我们首次系统地全面分析了DRAM1在33种癌症类型中的表达特征，整合了多组学数据，并通过实验验证来阐明其表达谱、预后意义和免疫调节功能。除了确认DRAM1在自噬网络中的核心位置（图4）外，我们还发现了DRAM1与一个免疫抑制轴之间的先前未被认识到的关联，该轴包括IFN-γ信号通路、JAK-STAT激活和Tregs浸润（图5, 7）——这种关系超出了其传统的自噬依赖性作用。这一发现得到了实验证据的支持，即DRAM1敲低可以减弱A549细胞中的STAT3磷酸化（图9）。总体而言，我们的研究提供了一个相关框架，表明DRAM1是肿瘤免疫微环境的上下文依赖性相关因子，并为其作为免疫治疗反应潜在生物标志物的进一步探索奠定了基础。DRAM1的上下文依赖性基础在于其组织特异性表达模式，正如我们的结果所详细展示的（图1）。它在胃肠道恶性肿瘤（COAD, STAD, READ）中的上调以及在腺癌（BRCA, PRAD）中的下调，表明其功能具有发育编程特性。这种异质性也体现在组织学亚型中，例如在卵巢癌中，DRAM1在透明细胞癌中显著上调。这种组织特异性特征在临床上具有重要意义，因为DRAM1的预后价值在同一器官内也存在显著差异——在LUAD中作为保护因素（HR = 0.61，图2C），而在LUSC中则构成风险因素（HR = 1.46，图2G），这种差异可能源于LUSC中浸润的免疫细胞而非肿瘤细胞本身的DRAM1表达。LUAD中DRAM1的肿瘤抑制作用还得到了最近一项研究的支持，该研究表明DRAM1在NSCLC组织中显著下调，且低DRAM1表达与不良预后相关。这种预后的二分性反映了DRAM1的分子双重性，包括在NSCLC中通过自噬降解EGFR的肿瘤抑制作用，以及在胶质母细胞瘤干细胞中促进迁移和侵袭的作用。这种上下文依赖性可能部分解释了p53改变的性质，因为同时消除p53的促凋亡和自噬调节功能的突变可以在致癌过程中起多重作用。此外，这种上下文依赖性的调控基础是多层次的，不仅涉及p53的转录调控，还包括FTSJ1对tRNA的修饰以及EZH2的表观遗传调控。肿瘤微环境本身也可以调节DRAM1的功能，例如在三维层粘连蛋白丰富的细胞外基质中培养的乳腺癌细胞中，多柔比星诱导的DRAM1表达受损。

功能上，我们的富集分析证实了DRAM1在核心自噬装置中的位置，它与自噬体形成、线粒体更新和溶酶体功能密切相关（图4）。这种分子定位通过最近关于DRAM1在稳定VAMP8以促进自噬体-溶酶体融合中的作用的结构性见解得到了机制上的阐明。这种自噬活性与观察结果一致，即自噬驱动MHC-I的溶酶体降解以支持免疫逃逸——这些发现加强了DRAM1介导的自噬对“冷”肿瘤表型的相关性。自噬在癌症中的作用是复杂且依赖于上下文的，它既可作为肿瘤抑制机制，也可作为已建立肿瘤的生存促进途径。除了这些经典功能外，DRAM1还作为一个信号节点，整合了自噬流与关键细胞过程——抑制IGF-1R信号通路，协调BAX介导的凋亡，并通过溶酶体-内质网连接维持细胞器稳态。这些基本机制可能解释了我们在不同癌症中观察到的多样化表型关联，促使我们探究DRAM1的功能是否扩展到肿瘤免疫微环境。我们研究的最重要进展是系统地描述了DRAM1的免疫调节能力，这一可能性在引言中提出但尚未探索（图5）。我们证明了DRAM1的表达与癌症类型的免疫浸润相关，尤其是与免疫抑制成分（尤其是Tregs和巨噬细胞）有很强的关联（图5N-P）。有趣的是，在酒精相关性肝病中，DRAM1通过增加肝细胞分泌富含PKM2的细胞外囊泡来促进巨噬细胞的激活，这与我们在癌症中观察到的DRAM1与巨噬细胞浸润之间的关联一致（图5E–G）。值得注意的是，抑制免疫刺激通路（如IFN-γ-JAK-STAT信号通路）已被确定为抵抗免疫检查点阻断的公认机制，这将我们发现的DRAM1相关轴置于免疫治疗抵抗的既定框架中。我们的实验验证表明，DRAM1敲低可以减弱A549细胞中的STAT3磷酸化（图9），支持DRAM1与JAK-STAT信号通路之间的调控联系。有趣的是，有报道称在EGFR突变细胞PC9和H1975中，DRAM1的过表达也会降低p-STAT3水平——这一观察结果看似矛盾，因为我们在A549细胞中的敲低产生了类似的效果。这种表面上的矛盾可以通过认识到DRAM1在不同细胞背景下通过不同机制调节STAT3来解释。在EGFR野生型细胞（A549）中，DRAM1通过p53/Src信号通路作为STAT3的正向调节因子，如在支气管上皮细胞中所证明的。相比之下，在EGFR突变细胞中，DRAM1促进EGFR降解，从而间接抑制STAT3激活。因此，A549细胞中DRAM1的丢失和EGFR突变细胞中DRAM1的增加都会破坏STAT3的激活——每种情况都是通过特定途径实现的，这突显了DRAM1-STAT3调控的上下文依赖性。LUAD中DRAM1的肿瘤抑制作用进一步得到了最近研究的支持，该研究表明DRAM1在NSCLC组织中显著下调，且低DRAM1表达与不良预后相关。这种预后的二分性反映了DRAM1的分子双重性，包括在NSCLC中通过自噬降解EGFR的肿瘤抑制作用，以及在胶质母细胞瘤干细胞中促进迁移和侵袭的作用。这种上下文依赖性可能部分解释了p53改变的性质，因为同时消除p53的促凋亡和自噬调节功能的突变可以在致癌过程中起多重作用。此外，这种上下文依赖性的调控基础是多层次的，不仅涉及p53的转录调控，还包括FTSJ1对tRNA的修饰和EZH2的表观遗传调控。肿瘤微环境本身也可以调节DRAM1的功能，例如在三维层粘连蛋白丰富的细胞外基质中培养的乳腺癌细胞中，多柔比星诱导的DRAM1表达受损。

功能上，我们的富集分析证实了DRAM1在核心自噬装置中的位置，它与自噬体形成、线粒体更新和溶酶体功能密切相关（图4）。这种分子定位通过最近关于DRAM1在稳定VAMP8以促进自噬体-溶酶体融合中的作用的结构性见解得到了机制上的阐明。这种自噬活性与观察结果一致，即自噬驱动MHC-I的溶酶体降解以支持免疫逃逸——这些发现加强了DRAM1介导的自噬对“冷”肿瘤表型的相关性。自噬在癌症中的作用是复杂且依赖于上下文的，它既可作为肿瘤抑制机制，也可作为已建立肿瘤的生存促进途径。除了这些经典功能外，DRAM1还作为一个信号节点，整合了自噬流与关键细胞过程——抑制IGF-1R信号通路，协调BAX介导的凋亡，并通过溶酶体-内质网连接维持细胞器稳态。这些基本机制可能解释了我们在不同癌症中观察到的多样化表型关联，促使我们探究DRAM1的功能是否扩展到肿瘤免疫微环境。我们研究的最重要进展是系统地描述了DRAM1的免疫调节能力，这一可能性在引言中提出但尚未探索（图5）。我们证明了DRAM1的表达与癌症类型的免疫浸润相关，尤其是与免疫抑制成分（尤其是Tregs和巨噬细胞）有很强的关联（图5N-P）。有趣的是，在酒精相关性肝病中，DRAM1通过增加肝细胞分泌富含PKM2的细胞外囊泡来促进巨噬细胞的激活，这与我们在癌症中观察到的DRAM1与巨噬细胞浸润之间的关联一致（图5E–G）。值得注意的是，抑制免疫刺激通路（如IFN-γ-JAK-STAT信号通路）已被确定为抵抗免疫检查点阻断的公认机制，这将我们发现的DRAM1相关轴置于免疫治疗抵抗的既定框架中。我们的实验验证表明，DRAM1敲低可以减弱A549细胞中的STAT3磷酸化（图9），支持DRAM1与JAK-STAT信号通路之间的调控联系。有趣的是，有报道称在EGFR突变细胞PC9和H1975中，DRAM1的过表达也会降低p-STAT3水平——这一观察结果看似矛盾，因为我们在A549细胞中的敲低产生了类似的效果。这种表面上的矛盾可以通过认识到DRAM1在不同细胞背景下通过不同机制调节STAT3来解释。在EGFR野生型细胞（A549）中，DRAM1通过p53/Src信号通路作为STAT3的正向调节因子。相比之下，在EGFR突变细胞中，DRAM1促进EGFR降解，从而间接抑制STAT3激活。因此，A549细胞中DRAM1的丢失和EGFR突变细胞中DRAM1的增加都会破坏STAT3的激活——每种情况都是通过特定途径实现的，这突显了DRAM1-STAT3调控的上下文依赖性。LUAD中DRAM1的保护性预后作用（图2C）与A549细胞中DRAM1敲低后p-STAT3的降低之间的明显差异可能可以通过细胞系特定的基线表达水平和mRNA数据不直接反映蛋白质功能来解释。据我们所知，这是首次在泛癌症中提出一个连贯的DRAM1-IFN-γ-JAK-STAT-Tregs轴的研究，为理解DRAM1如何在肿瘤微环境中促进免疫抑制网络的形成提供了具体的机制框架（图7B）。这一轴还得到了TAMs的支持，TAMs通过CCL22-CCR4通路招募Tregs并激活JAK-STAT信号通路以促进PD-L1表达。值得注意的是，在自身免疫疾病（如原发性免疫性血小板减少症）中也记录了类似的Tregs异常，这突显了Tregs失调在免疫相关疾病中的保守作用。这些发现与我们的结果一致，表明DRAM1与Tregs浸润和免疫检查点分子（图6和7H–J）相关，并与自噬作为TIME中的关键信号节点的既定范式一致，能够通过维持Tregs的稳态和功能来增强免疫抑制网络。DRAM1与IFNG表达之间的异常强相关性（ρ = 0.742）将IFN-γ定位为一个合理的上游调节因子，这与已知的IFN-γ诱导DRAM1的作用一致。随后与JAK-STAT成分和Tregs标记物（FOXP3, CTLA4）的相关性完成了这一信号通路，表明DRAM1高表达的微环境有利于Tregs的招募和功能。我们的发现表明，DRAM1的表达与Tregs浸润和关键抑制性检查点（如CTLA4）相关，这与Tregs在肿瘤组织中大量浸润并发挥强大免疫抑制作用的既定范式一致。此外，JAK-STAT通路与我们的数据将DRAM1表达与PD-L1表达联系起来，它是癌症和衰老细胞中PD-L1转录的公认上游调节因子。Tregs在肝细胞癌中的功能重要性已得到充分证实，研究表明肿瘤内的Tregs比肿瘤周围和外周的Tregs具有更高的频率和更强的抑制活性。这一点通过PD-1阻断在经典霍奇金淋巴瘤（cHL）中的有效性得到了证实，强调了这一免疫轴的临床影响。DRAM1与JAK-STAT通路之间的联系还得到了我们实验数据的支持，该数据显示DRAM1敲低可以减弱A549细胞中的STAT3磷酸化（图9），这与已建立的STAT3在自噬调节中的关键作用一致。

DRAM1的这种免疫调节功能扩展到了治疗反应中，正如我们的结果所分析的。我们的分析揭示了其与药物敏感性的一致性，特别是与达沙替尼和博莱霉素，同时也发现了对HDAC抑制剂和多柔比星的耐药性（图8A,B）。多柔比素的发现得到了Gomes等人的机制支持，他们证明DRAM1作为p53依赖的自噬激活剂在传统2D培养中驱动化疗耐药性，而在3D微环境中其诱导受损使癌细胞对该药物敏感。这突显了微环境背景对DRAM1介导的自噬结果的关键决定作用。最重要的是，DRAM1对免疫治疗反应的预测价值，我们的差异表达分析（图8C–E）显示在三个独立队列中，响应者的DRAM1表达显著更高，ROC分析（图8F–K）得出的AUC值高达0.742。由于Tregs以高表达免疫检查点分子（如CTLA4）为特征，我们发现DRAM1与CTLA4和其他检查点相关，为这种预测价值提供了机制上的合理性，并表明DRAM1高表达的免疫抑制轴可能容易受到检查点阻断策略的影响。DRAM1与Tregs浸润和有利免疫治疗反应之间的矛盾关联可以通过最近的证据来调和，这些证据表明IFNγ可以将Tregs重新编程为抗肿瘤效应细胞。具体来说，在IFNγ丰富的条件下，一部分Tregs获得了分泌IFNγ的能力，并表现出降低的抑制功能，从而有助于而不是抑制抗肿瘤免疫。这种预测能力可能反映了DRAM1与我们发现的免疫抑制轴的关联，表明在DRAM1高表达的肿瘤中，Tregs可能被IFNγ丰富的微环境重新编程。需要直接的实验验证来测试这一假设。然而，这种关系的上下文依赖性通过不同癌症类型中的相反发现得到了强调——这突出了组织特异性解释的必要性。未来的研究应该解决以下问题。首先，需要单细胞RNA测序和空间转录组学来解析DRAM1的细胞类型特异性作用。其次，虽然我们的实验验证表明DRAM1敲低可以减弱STAT3磷酸化，但所提出的相关模式需要机制验证（例如，通过共免疫沉淀和拯救实验）。第三，我们在A549细胞中的体外发现应该扩展到其他癌细胞系、体内模型和免疫共培养系统。因此，这项研究为进一步探究DRAM1-IFN-γ-JAK-STAT-Tregs特征的功能和治疗相关性提供了相关框架。

5 结论

这项全面的泛癌症分析确立了DRAM1作为一个依赖于上下文的调节因子，位于自噬和癌症免疫的交叉点，解决了系统泛癌症特征描述和DRAM1在免疫信号通路中的功能验证的关键空白。通过整合33种癌症类型的多组学数据并进行功能实验验证，我们证明了DRAM1调节STAT3磷酸化，将其定位为IFN-γ-JAK-STAT-Tregs免疫抑制网络中的功能节点——这是一个机制上得到支持、临床上相关的框架，用于理解其在塑造肿瘤免疫微环境中的作用。此外，DRAM1在多个独立队列中对化疗耐药性和免疫治疗反应显示出显著的预测价值，使其成为肿瘤免疫环境的潜在生物标志物。未来的工作应专注于进一步解析这一轴的机制，并探索其在特定患者群体中的治疗相关性。

作者贡献

吴金春和杨海玲对这项工作做出了同等贡献。概念化和监督由程云峰和华凡莉完成。吴金春、杨海玲和曹静静负责数据整理。正式分析由吴金春、杨海玲和杨敏完成。方法论由吴金春、杨海玲、曹静静和杨敏共同开发。万桥曹和永雷刘进行了实验验证，包括细胞培养、siRNA转染和Western blot分析。项目管理和资源由程云峰和华凡丽提供。静静曹和杨敏也参与了验证工作。吴金春和杨海玲负责数据可视化，并撰写了初稿。所有作者都参与了研究，并对稿件进行了审阅和编辑。

**致谢**
作者感谢本研究中使用的公共数据库和生物信息学平台的贡献者和维护者，包括TCGA、GTEx、GENT2、TIMER3、GEPIA3、GSCA、STRING、TISIDB、Kaplan–Meier绘图工具等，它们提供了宝贵的数据和分析工具，使得这项泛癌症分析成为可能。本研究得到了复旦大学青浦分校中山医院探索性研究项目（项目编号QYT2023-01）和中国国家自然科学基金（项目编号82300146）的支持。资助机构未参与研究设计、数据收集与分析、结果解释、稿件撰写或决定发表文章的决策过程。

**伦理声明**
本研究使用了来自TCGA和GTEx等公开数据库的数据，这些数据已经去标识化处理，符合伦理标准。因此，本次分析无需单独的伦理批准。

**利益冲突声明**
作者声明不存在利益冲突。

**数据可用性声明**
本研究分析的数据来源于方法部分详细列出的公开资源，包括GENT2、TIMER3、GEPIA3、GSCA、STRING、TISIDB、GDSC和CTRP。所有来自这些平台的数据均来自公开渠道。本研究生成的Western blot数据可应合理要求向通讯作者索取。