《HUMAN MUTATION》：MLH1 Constitutional Epimutation Screening Requires Highly Sensitive Assays to Identify Lynch Syndrome Patients With Very Low Mosaic Methylation Level
编辑推荐：
MLH1 基因的胚系表观突变是林奇综合征（Lynch syndrome, LS）的一类非经典致病原因，其特征是错配修复（mismatch repair, MMR）基因的一个等位基因失活并非由致病性遗传变异导致，而是由 MLH1 启动子甲基化引起。此类表观突变常
MLH1 基因的胚系表观突变是林奇综合征（Lynch syndrome, LS）的一类非经典致病原因，其特征是错配修复（mismatch repair, MMR）基因的一个等位基因失活并非由致病性遗传变异导致，而是由 MLH1 启动子甲基化引起。此类表观突变常呈嵌合状态，在携带者外周血中可检测到约 50% 的单等位基因甲基化至 1%–5% 的低水平甲基化。研究人员在 2020 年至 2024 年间，针对 142 例 61 岁前确诊且肿瘤存在 MLH1 甲基化的患者，采用高灵敏度的特异性液滴数字甲基化特异性 PCR（droplet digital methyl-specific PCR, ddMSP）检测，识别出 6 例甲基化水平低于 1% 的患者，这些病例在常规焦磷酸测序中均被漏检，凸显了高灵敏度检测在胚系表观突变筛查中的必要性。为排除 ddMSP 检测到的甲基化 DNA 分子来源于循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）而非胚系 DNA，研究人员进行了多项验证，包括在其他胚系 DNA 来源及肿瘤分析中验证甲基化的胚系起源。结合同期经焦磷酸测序确诊的其他胚系表观突变携带者，在 61 岁前确诊且肿瘤 MLH1 甲基化的患者中，13.1% 最终确诊为林奇综合征，这一结果改变了患者的临床随访策略。研究结果表明，对 61 岁前确诊且肿瘤 MLH1 甲基化的患者，应系统性采用高灵敏度检测方法进行 MLH1 胚系表观突变筛查，这将提高因 MLH1 胚系表观突变所致林奇综合征的检出率，改善患者诊疗结局并优化遗传咨询。
本研究发表于《HUMAN MUTATION》，围绕 MLH1 胚系表观突变在低甲基化水平下的漏检问题展开，旨在提升林奇综合征的精准诊断率。林奇综合征是一种常染色体显性遗传性癌症易感综合征，主要由 MMR 基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）的胚系致病变异引起。除遗传变异外，胚系表观突变也是重要致病机制，表现为 MLH1 启动子 CpG 岛单等位基因甲基化导致转录沉默，可在正常组织中广泛存在。这类表观突变分为原发性（多为新发，无孟德尔遗传）和继发性（与顺式遗传改变相关，可孟德尔遗传）。当前临床指南将肿瘤 MLH1 启动子双等位基因甲基化视为散发性肿瘤的标志，因此携带胚系表观突变的患者常被误判为散发病例，错失遗传诊断和针对性随访的机会。此外，胚系表观突变在外周血中常呈嵌合状态，甲基化水平可低至 1%–5%，常规焦磷酸测序的检测限约为 3%–5%，难以识别极低水平甲基化，导致漏诊。为此，研究人员在临床试验中引入更高灵敏度的 ddMSP 技术，对既往焦磷酸测序阴性的患者样本进行复筛，并结合多组织验证区分胚系甲基化与 ctDNA 污染，明确其在林奇综合征诊断中的临床价值。
研究人员主要采用以下关键技术方法：研究纳入 2020–2024 年间法国多家大学医院和癌症中心转诊的 146 例患者，均为 61 岁前确诊的错配修复缺陷（dMMR）肿瘤且肿瘤 MLH1 启动子发生体细胞高甲基化，初次焦磷酸测序结果为阴性；采用 ddMSP 技术检测外周血及其他胚系来源 DNA 的 MLH1 甲基化水平，该技术可绝对定量并检测低至 0.1% 的甲基化分子；通过二次采血、唾液、颊拭子及远离肿瘤的非肿瘤组织等多来源样本验证甲基化的胚系起源；利用焦磷酸测序分析肿瘤中 MLH1 基因的杂合性缺失（LOH）及 Sanger 测序排查已知关联变异，综合判断表观突变性质。
研究结果如下：
3.1 极低水平 MLH1 胚系甲基化患者的识别
在 143 例可用 DNA 样本中，ddMSP 检出 7 例外周血 MLH1 甲基化水平介于 0.24%–0.95% 的患者，中位诊断年龄为 45 岁，肿瘤类型以近端结肠癌为主。其中 1 例因缺乏验证样本被排除，其余 6 例进入后续分析。
3.2 正常组织中广泛嵌合状态的验证
为排除 ctDNA 干扰，研究人员在远离肿瘤治疗期采集二次血样，并通过细胞游离 DNA 检测确认无显著 ctDNA 污染。甲基化信号在二次血样、唾液、颊黏膜及非肿瘤组织中均被验证，证实其为胚系来源的广泛嵌合甲基化，水平大多低于 1%。
3.3 肿瘤分析
在 4 例可评估的肿瘤样本中，ddMSP 检测肿瘤 MLH1 甲基化水平为 13.11%–55.9%，均低于 100%。其中 2 例检出 LOH，另 2 例检出体细胞 MLH1 致病变异，表明肿瘤中存在“单等位基因胚系甲基化+另一等位基因体细胞失活”的二次打击事件，符合胚系表观突变特征，而非散发性肿瘤的双等位基因甲基化模式。
3.4 MLH1 胚系表观突变的频率
结合同期焦磷酸测序检出的 15 例携带者，在 160 例 61 岁前确诊且肿瘤 MLH1 甲基化的患者中，共检出 21 例胚系表观突变携带者，占 13.1%；若限定年龄小于 56 岁，检出率升至 19.6%。
3.5 极低甲基化患者的胚系变异筛查
对 6 例患者的 MLH1 基因 5′ 非翻译区、外显子 1 及内含子 1 起始区域进行测序，未发现已报道的与低水平甲基化相关的变异；仅 1 例检出意义未明的 MLH1 外显子 1–13 重复，其与甲基化的关联尚未确认。
3.6 亲属表观突变筛查
仅对 3 名一级亲属进行检测，均未发现显著甲基化，提示多数病例可能为原发性新发表观突变。
3.7 ddMSP 对焦磷酸测序低水平结果的验证
对 2 例焦磷酸测序检出临界阳性（4%、5.5%）的患者，ddMSP 验证了低水平甲基化的存在，并在多组织中确认胚系起源。
在讨论部分，研究人员指出，MLH1 胚系表观突变的甲基化水平可低于 1%，常规方法易漏检，而 ddMSP 通过微滴分区实现罕见靶标的绝对定量，检测下限可达 0.1%，显著提升了检出能力。研究证实，对 61 岁前确诊且肿瘤 MLH1 甲基化的患者进行系统性胚系表观突变筛查，可使 13.1% 的患者获得林奇综合征确诊，从而纳入规范化监测并指导亲属风险预警。尽管年轻患者的检出率更高，但将筛查年龄限定为 56 岁以下会遗漏部分病例，因此推荐对所有 61 岁前发病者进行筛查。此外，极低水平嵌合甲基化仍具临床致病性，且与家族史无必然关联，不能仅凭家族史排除筛查指征。研究结论强调，MLH1 胚系表观突变筛查应成为 61 岁前 MLH1 甲基化肿瘤患者的标准诊疗环节，必须采用高灵敏度检测并结合多组织验证以确保诊断准确性。
