《HUMAN MUTATION》：Integrating Bulk and Single-Cell RNA-Seq Reveals Glycolysis-Associated Macrophages and Its Related Tumor Subgroup Signatures to Predict Prognosis and Therapy in Clear Cell Renal Cell Carcinoma
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背景：透明细胞肾细胞癌（Clear Cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC）是肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）最常见的组织学类型，具有侵袭性强和生存率差的特点。然而，治疗选择有限且效果不佳。巨噬细胞在cc
背景：透明细胞肾细胞癌（Clear Cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC）是肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）最常见的组织学类型，具有侵袭性强和生存率差的特点。然而，治疗选择有限且效果不佳。巨噬细胞在ccRCC中表现出显著的异质性，对肿瘤的恶性进展和治疗抵抗产生重大影响。
方法：本研究利用单细胞测序和转录组学，以鉴定与糖酵解相关的巨噬细胞亚群及与之相互作用最密切的肿瘤细胞亚群，旨在探索巨噬细胞与ccRCC风险之间的联系。此外，通过采用机器学习技术，研究人员构建了一个精确的基因特征来预测患者预后，并评估了其临床意义。
结果：研究人员识别出一个以糖酵解代谢为主要特征的巨噬细胞亚群，以及一个与之密切相关的肿瘤细胞亚群，两者均与ccRCC患者的不良预后显著相关。随后，利用高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）来识别细胞亚群的关键基因和功能模块，并使用101种机器学习方法在ccRCC患者的RNA测序（RNA-seq）队列中建立了一个由六个基因组成的预后模型，这六个基因是：CENPA、ITM2B、TUBA1B、TNFSF13B、SNX3和TNNT1。高风险组患者表现出更差的预后，功能富集分析表明存在与恶性进展相关的模块。此外，免疫浸润分析显示该组具有更高水平的免疫细胞浸润，表明其对免疫治疗干预具有潜在的响应性。
结论：该研究提出了一个新的、稳健的ccRCC预后模型，为ccRCC患者的精准治疗提供了新的见解和潜在的治疗策略。
一、研究背景、问题与目的
肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）是一种全球范围内高发的恶性肿瘤，其中透明细胞肾细胞癌（Clear Cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC）约占70%，是主要的病理亚型。ccRCC具有侵袭性强、预后差的特点，早期诊断至关重要。目前，手术切除是主要治疗手段，但患者预后仍不理想，亟需探索其发病的分子机制以寻找更有效的治疗策略。
肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment, TIME）在癌症进展和免疫逃逸中扮演关键角色。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）是TIME中的重要组成部分，具有高度的可塑性，既可发挥抗肿瘤作用，也可能在肿瘤微环境中被“驯化”，转变为促肿瘤表型，从而促进肿瘤进展、血管生成并抑制免疫反应。巨噬细胞的代谢重编程，特别是向糖酵解代谢的转变，与其功能状态密切相关，但糖酵解相关的巨噬细胞亚群在ccRCC中的具体特征、与肿瘤细胞的相互作用及其临床意义尚不完全清楚。
为填补这一知识空白，本研究旨在整合单细胞RNA测序和批量RNA测序数据，深入解析ccRCC中与糖酵解相关的巨噬细胞亚群，鉴定与之互作的关键肿瘤细胞亚群，并基于机器学习方法构建一个稳健的基因特征模型，以预测患者预后、评估免疫微环境特征及潜在治疗反应，从而为ccRCC的精准诊断和治疗提供新的生物标志物和策略。本研究成果发表于《HUMAN MUTATION》期刊。
二、主要关键技术方法
为达成上述研究目标，研究人员综合运用了多种生物信息学和实验技术。主要技术方法包括：
- 1.
数据获取与预处理：从公共数据库获取了单细胞RNA测序数据集（GSE178481）和批量RNA测序数据（TCGA-KIRC队列），并对单细胞数据进行了严格的质控和标准化整合。
- 2.
单细胞数据分析：使用UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）进行降维和细胞聚类，识别不同的细胞类型和亚群。利用伪时间轨迹分析（Monocle3）推断巨噬细胞的发育路径，并利用CellChat软件进行细胞间通讯分析。
- 3.
生物信息学建模与特征筛选：应用高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）识别与特定细胞亚群相关的基因模块和枢纽基因。通过集成101种机器学习算法组合（包括随机生存森林、Lasso、Cox回归等），从候选基因中筛选并构建最优的预后特征模型。
- 4.
功能与通路富集分析：利用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）、基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，探究差异表达基因的生物学功能。
- 5.
免疫微环境与治疗预测：采用多种算法（如CIBERSORT、xCell等）评估肿瘤免疫细胞浸润水平，并使用Submap算法和pRRophetic R包分别预测患者对免疫检查点抑制剂（如CTLA-4阻断）和化疗药物的潜在反应。
- 6.
实验验证：通过定量实时聚合酶链反应（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）在正常人肾小管上皮细胞系（HK-2）和ccRCC细胞系（786-O, 769-P）中，对机器学习模型筛选出的关键枢纽基因的mRNA表达水平进行了验证。
三、研究结果
3.1. 单细胞RNA序列数据整合与聚类及糖酵解相关巨噬细胞亚群的鉴定
研究人员对来自25个ccRCC样本的152,218个单细胞进行了整合与聚类分析，识别出包括B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等在内的12种主要细胞类型。对巨噬细胞进一步细分出7个亚群。通过代谢通路评分发现，名为Marco1的巨噬细胞亚群具有最高的糖酵解评分，且与患者的不良总生存期（Overall Survival, OS）显著相关，表明Marco1是一个与糖酵解密切关联且预后不良的巨噬细胞亚群。
3.2. hdWGCNA鉴定Marco1中与免疫相关的枢纽基因
通过对巨噬细胞进行hdWGCNA分析，研究人员确定了7个基因共表达模块。其中，绿色、棕色和黑色模块在Marco1亚群中评分最高。对这3个模块的基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析和功能富集，发现枢纽基因如CDC20、CTSS、RRM2，且这些模块的功能与免疫抑制、病毒蛋白-细胞因子相互作用等通路显著相关。
3.3. 伪时间轨迹重建及与巨噬细胞亚群的细胞间通讯分析
伪时间轨迹分析显示，糖酵解相关的巨噬细胞亚群处于发育轨迹的终点，可能代表一种促进肿瘤进展的终末极化状态。基因热图分析强调了ANXA2、TUBA1B、LYZ、VIM和TNNT1等基因在ccRCC发生发展中的重要性。细胞间通讯分析进一步发现，肿瘤细胞亚群Tumor0与糖酵解巨噬细胞亚群存在最强的相互作用。生存分析证实，Tumor0亚群与患者的不良OS显著相关。对Tumor0进行的hdWGCNA分析揭示了红色、棕色和黄色等基因模块，其枢纽基因包括VIM、GPX3、SPP1，功能富集于巨噬细胞凋亡、中性粒细胞激活、HIF-1信号通路和糖酵解/糖异生等过程。
3.4. 整合构建共识特征
在TCGA队列中，研究人员通过评估101种预测模型，发现StepCox（后向）与随机生存森林（Random Survival Forest, RSF）的组合模型具有最高的平均一致性指数（C-index）。该模型最终筛选出6个枢纽基因（CENPA, ITM2B, TUBA1B, TNFSF13B, SNX3, TNNT1），并据此计算风险评分。根据风险评分中位数将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存分析和受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic curve, ROC）分析在训练集（TCGA）和多个独立验证集（ICGC, MTAB-3218）中均证实，高风险组患者的OS率显著低于低风险组，模型展现出良好的预后预测效能。
3.5. 空间转录组数据集中鉴定基因的表达模式
在空间转录组（Spatial Transcriptomics, ST-seq）数据中，研究人员观察到这6个枢纽基因在肿瘤区域呈异质性但富集的表达模式。基因集变异分析（GSVA）进一步显示，这些基因高表达的区域与增强的糖酵解活性共定位，提示它们与肿瘤微环境中的代谢重编程密切相关，并且巨噬细胞与肿瘤细胞在空间上可能存在物理相互作用。
3.6. 高风险与低风险组差异表达基因的富集分析
对高低风险组进行差异基因表达分析，共鉴定出90个高表达基因和60个低表达基因。基因本体（GO）富集分析显示，上调基因富集于有机阴离子转运、羧酸转运、肾脏系统发育等过程；下调基因富集于体液免疫反应、对细菌的防御反应等过程。KEGG通路分析表明，上调基因显著富集于PI3K-Akt、PPAR、Rap1等促增殖和代谢信号通路；而下调基因则富集于IL-17、冠状病毒病-COVID-19等免疫相关通路。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进一步证实，高风险组中炎症反应、同种异体移植排斥、干扰素-γ反应等通路被激活。
3.7. 免疫微环境与高低风险组的关联
通过多种算法评估免疫浸润发现，高风险组表现出更高的免疫评分、基质评分和估计评分，但肿瘤纯度较低。高风险组中免疫调节分子和免疫检查点（如CTLA-4, PD-1）的表达也显著更高。免疫循环评分分析显示，高风险组在癌细胞抗原释放、免疫细胞启动与激活、免疫细胞向肿瘤的迁移以及T细胞对癌细胞的识别等步骤上评分更高，提示其可能具有“免疫排斥”型微环境特征。免疫治疗响应预测显示，高风险组可能对CTLA-4抑制剂治疗更敏感。药物敏感性分析预测，高风险组对X3.Cl.AHPC、CD.437等药物可能耐药，而对丹司他（danusertib）、长春新碱（vincristine）等药物，低风险组可能更敏感。
3.8. 实验验证结果
qPCR实验验证表明，与正常肾小管上皮细胞系HK-2相比，6个枢纽基因在ccRCC细胞系786-O和769-P中均显著上调，其中CENPA和TNNT1的上调幅度最为显著。这为生物信息学分析结果提供了直接的实验证据，支持了该特征基因在ccRCC恶性进展中的生物学相关性。
四、讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，本研究首次在ccRCC中系统鉴定了以糖酵解代谢为特征的巨噬细胞亚群Marco1及其密切互作的肿瘤细胞亚群Tumor0，两者均与不良预后相关。通过整合单细胞与批量转录组数据及先进的机器学习算法，构建并验证了一个由6个基因（CENPA, ITM2B, TUBA1B, TNFSF13B, SNX3, TNNT1）组成的稳健预后模型。该模型在多个独立队列中均能有效区分患者预后。功能分析表明，高风险组与肿瘤恶性表型、增殖代谢通路激活以及免疫抑制性微环境密切相关。药物敏感性预测为高风险患者提示了潜在的靶向治疗（如CTLA-4抑制剂）和化疗药物选择。实验验证进一步证实了特征基因在ccRCC细胞系中的上调表达。尽管本研究基于回顾性数据存在一定的局限性，但所构建的模型为ccRCC的预后评估、免疫微环境解析及个性化治疗策略制定提供了有价值的工具和见解。靶向糖酵解重编程的肿瘤相关巨噬细胞，可能是与免疫检查点抑制剂联合治疗ccRCC的有前景的策略。
结论：本研究的主要目标是鉴定一个特别强调糖酵解代谢的独特巨噬细胞亚群及其在细胞间相互作用中最相关的肿瘤亚群。随后，研究人员旨在开发与这两个实体密切相关的基因特征签名，以实现对患者的准确预后预测。利用101种不同的机器学习算法，研究人员生成了性能最佳的基因特征，并确定了六个核心基因（CENPA、ITM2B、TUBA1B、TNFSF13B、SNX3和TNNT1）。这些基因与患者预后和免疫浸润相关。研究人员坚信，进一步探索这些涉及巨噬细胞与肿瘤相互作用的基因，将对理解ccRCC的恶性进展产生更深刻的认识。机器学习算法的多种组合为揭示ccRCC新的生物学标志物提供了一条有希望的途径，从而有助于改进诊断和治疗策略。
