基于全基因组测序的Cronobacter sakazakii ST4在爱尔兰乳粉生产设施中的持续存在监测

《Food Science & Nutrition》：Whole-Genome Sequencing-Based Monitoring of Cronobacter sakazakiiST4 Persistence in an Irish Dairy Powder Facility

**摘要**

Cronobacter sakazakii是一种新出现的食源性病原体，与新生儿感染有关，在奶粉加工设施中存在显著风险，尤其是那些为配方奶粉（PIF）提供原料的设施。本案例研究采用了全基因组测序（WGS）技术，在爱尔兰一家大规模高蛋白奶粉厂中监测了C. sakazakii的持续存在情况，时间跨度为12个月，重点关注了超滤、蒸发、喷雾干燥和包装区域。每月从20个固定位置收集240份环境拭子样本，并使用ISO 22964方法进行分析，随后通过实时PCR进行确认，并利用Illumina平台进行WGS以表征分离株。共分离出88株Cronobacter spp阳性样本。多基因座序列分型确定了四种序列类型，其中10株ST4型分离株与临床脑膜炎相关。系统发育分析显示存在两个不同的ST4分支：一个分支持续存在但空间分布有限（分离株K08和C19），在几个月内零星检测到；另一个克隆群体则表现出时间上的增殖，在最后一个月多个干燥器层级达到高峰。这些发现表明存在反复的污染事件和长期的病原体持续存在，突显了WGS在追踪病原体动态方面相较于传统分型方法的优越性。作为新的黄金标准，WGS方法提供了最高的分辨率、最多的信息量、永久的可追溯性、更低的成本以及更快的细菌分析速度——这些都是多重基因座序列分型（MLST）无法比拟的优势。该研究证明了WGS是增强乳制品设施监测能力的强大工具，能够早期发现污染风险，并为有针对性的卫生干预提供依据，从而保护配方奶粉供应链的安全。

**1 引言**

Cronobacter spp.常与配方奶粉相关联。这种细菌被认为是一种新兴的食源性病原体，已导致多起疫情（参见Singh等人，2015年的研究）。已有大量关于Cronobacter sakazakii引起的婴儿感染的病例记录（Mullane等人，2007年）。近年来，配方奶粉行业在控制C. sakazakii方面做出了显著努力。缓解策略包括加强对原材料、环境和产品的监测，并在生产区域引入干清洁程序，以减少有利于C. sakazakii繁殖的潮湿环境。对C. sakazakii的原材料监测加强后，人们更加关注制造奶粉及可能用于配方奶粉生产的原料的乳制品加工设施中的病原体监测。其他奶粉制造设施中也报告了C. sakazakii的出现。Von Westerholt（2018年）对一家乳制品原料制造设施中的C. sakazakii进行了监测，并分离出一些ST4和ST99基因型的菌株。此外，至少从传闻来看，乳制品原料公司也开始将Cronobacter spp.作为其整体环境卫生监测计划中的额外指示菌，以补充大肠菌群或肠杆菌科等更传统的指示菌。尽管采取了这些广泛的控制措施，但由于C. sakazakii对干燥的极强耐受性和其在地板、设备和空气处理系统等表面形成生物膜的能力，它仍经常被报告为干乳制品加工环境中的常驻污染物（Tong等人，2024年）。特别值得关注的是ST4序列型，这是全球主要的临床谱系，与严重的新生儿脑膜炎和坏死性小肠结肠炎密切相关，其侵袭性和病例死亡率明显高于其他ST型（Forsythe等人，2014年）。从乳制品原料设施中反复分离出ST4和其他基因型（Von Westerholt，2018年）表明，即使在非配方奶粉产品中，也存在巴氏杀菌后重新污染的风险。Cronobacter spp.的耐热性不足以使其在巴氏杀菌过程中存活，因此污染通常发生在粉末的最终干燥和包装阶段。当原奶到达乳制品原料工厂时，会通过HTST处理（至少加热至72°C并保持该温度至少15秒）进行巴氏杀菌，这一过程可以杀死大多数细菌，包括Cronobacter spp.。接下来的步骤是浓缩和喷雾干燥。喷雾干燥涉及将牛奶雾化成热空气流（180°C–220°C）。喷雾干燥器中可以控制液滴大小、空气温度和气流。这一步骤的主要目的不是利用高温灭活细菌，因此需要考虑Cronobacter spp.存活的可能性。鉴于巴氏杀菌能有效消除原奶中的Cronobacter spp.，最终粉末产品的污染几乎完全来源于热处理后的干燥加工环境。这些区域的低水分活性和定期的干清洁操作为耐干燥的Cronobacter菌群创造了长期存在的生态位（Tong等人，2024年）。这意味着如果Cronobacter spp.在巴氏杀菌后的生产环境中存在，它可能会污染最终产品。因此，在加工区域对Cronobacter spp.进行环境监测对于早期预警潜在的污染存在至关重要。本研究的目的是在爱尔兰一家大规模高蛋白奶粉加工设施的环境中进行长期监测，以使用全基因组测序作为指纹工具来监测乳制品加工环境中的细菌病原体。该奶粉并非用于配方奶粉或特殊医疗用途的食品。监测包括每月从超滤过程、蒸发、喷雾干燥和粉末包装区域采集环境拭子样本。监测持续了一年，以捕捉环境中Cronobacter spp.出现的季节性变化。尽管全基因组测序（WGS）已成为追踪疫情来源的强大工具，但其在单个制造设施中用于长期（≥12个月）、高分辨率的纵向监测Cronobacter spp.以阐明克隆持续性和传播动态的应用仍然较为罕见（Mousavi等人，2023年）。下一代测序技术用于识别和表征从设施中回收的所有阳性Cronobacter spp.分离株，以便精确识别从加工环境中回收的分离株。结合其他空间和时间元数据，基因组数据被用来确定潜在的污染源和病原体在加工环境中的持续存在。

**2 材料与方法**

**2.1 牛奶蛋白浓缩生产设施**

研究的加工设施是一家生产高蛋白奶粉的爱尔兰乳制品厂。这种奶粉并非用于配方奶粉制造。本研究重点关注了浓缩和最终喷雾干燥过程的加工环境。在12个月的时间里对该设施的加工环境进行了监测。选择了20个采样点，每月采样一次。在20个采样点中，1-7号位于湿加工区域，每天进行湿清洁，表面采用耐热、防水和耐化学物质的材料；其余8-20号位于干加工区域，采用常规干清洁。干加工区域的地板由环氧树脂制成，塔架和类似设备的表面为抛光不锈钢，工具如刷子和铲子为食品级塑料。所有样本均在室温下采集。总共收集了240份样本。表1列出了选定的采样点，包括设备表面、墙壁、固定装置和地板；以及操作人员使用的刷子和铲子等设备。

**2.2 环境采样**

使用无菌拭子（Sani-Stick套件，Labplas，魁北克）对20个位置的表面进行采样。Sani-Stick是一种带有集成把手的不无菌海绵，装在TWIRL'EM无菌采样袋中（图1）。采样后，释放把手并将海绵放入120毫升无菌袋中并密封。制造设施的质量控制人员使用无菌模板来标记采样区域，模板尺寸为10厘米×10厘米。采样技术包括向下擦拭三次、对角线擦拭三次以及从左向右擦拭三次。后续重复样本从表1中指定的大致相同位置采集。采样后立即将拭子冷藏在4°C。第二天，将拭子转移到都柏林大学学院进行冰盒运输，并在4°C下储存过夜，以便次日的微生物分析。

**2.3 Cronobacter spp. 的检测**

收到样本后的第二天，根据ISO 22964标准（ISO 2017）对样本进行了Cronobacter spp.的检测。将海绵转移到280毫升 stomacher袋中，然后加入90毫升缓冲蛋白胨水（CM0509，Oxoid），并在其中浸泡2分钟。将液体倒入无菌120毫升试管中，然后在37°C下培养18-24小时。随后将100微升液体接种到10毫升Cronobacter筛选肉汤（CM1121，Oxoid）中，并加入一管万古霉素补充剂（5毫克，SR0247E，Oxoid），并在42°C下培养18-24小时。颜色从紫色变为黄色表明存在Cronobacter spp.，即假阳性结果。对于假阳性样本，用10微升接种环将阳性样本划线接种到ESIA（Enterobacter sakazakii分离琼脂）（CM1134，Oxoid）上，并在37°C下培养18-24小时。空白平板作为阴性对照，C. sakazakii菌株ATCC 29544（GenBank FR714908.1）作为阳性对照。阳性结果表现为蓝色菌落。240个样本中有88个显示为Cronobacter spp.阳性。对于阳性样本，从ESIA平板上挑取一个菌落并划线接种到Tryptic Soya琼脂上，然后在37°C下培养10-24小时。将菌落从TSA平板重新悬浮到含有20%甘油的Tryptic Soya肉汤中，用于低温储存。样本在-20°C下储存，以便进一步通过分子分析进行确认。

**2.4 Cronobacter spp. 的实时PCR确认**

为了确认分离结果，使用了实时PCR。从ESIA或TSA平板上（根据情况）挑选一个阳性菌落。用1微升接种环挑取菌落，并将其均匀接种到含有1.5毫升无菌50微摩尔/升水的离心管中。涡旋后提取DNA，然后将试管在90°C的加热块上煮沸10分钟。接着，以10,000转/分钟的速度离心2分钟以沉淀细胞碎片。准备RT-PCR试剂。使用的引物见表2。将DNA提取物加入RT-PCR试剂中，并加载到Rotorgene R-3000实时PCR仪上进行分析。当扩增曲线显示典型的S形曲线且定量循环（Cq）值≤35时，认为分离株为Cronobacter spp.阳性（Drudy等人，2006；Mullane等人，2008；Seo和Brackett，2005）。

**2.5 全基因组测序**

**2.5.1 DNA提取和质量控制**

使用Mo Bio微生物DNA分离试剂盒（Qiagen Catalog#12224–250）提取微生物DNA。DNA提取是按照Qiagen发布的协议（https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/dna-purification/microbial-dna/dneasy-ultraclean-novipure-microbial-kits/?catno=12224-250）进行的。在测序之前，使用Nanodrop和Qubit方法确定了DNA的质量。使用Nanodrop ND-1000分光光度计来测试DNA浓度，将2 μL的样本加载到分光光度计上进行分析。还使用了Qubit荧光计2.0来测试DNA的质量，使用了Qubit dsDNA BR（宽范围）检测试剂盒。将2 μL的DNA样本加入稀释的检测试剂中，然后在Qubit荧光计上读取浓度。使用NanoDrop ND-1000上的A260/A280和A260/A230比率来评估DNA的纯度。A260/A280比率在1.8–2.0之间以及A260/A230比率大于1.8的样本被认为是可接受的。用于文库制备的最终DNA浓度范围为50至150 ng/μL（通过Qubit dsDNA BR检测），最小总产量为1 μg。后续测序的典型可接受DNA浓度约为100 ng/μL。SNP鉴定和系统发育分析是使用C. sakazakii菌株SP 291的封闭基因组（GenBank CP00491.1）作为参考菌株进行的。

2.5.2 基因组测序
提取的DNA样本被送往Novogene PLC（英国剑桥）进行商业测序。测序是在Illumina Hiseq PE150上进行的，名义覆盖度超过100倍。

2.6 生物信息学
2.6.1 原始读段的质量评估和修剪
首先使用FastQC（https://qubeshub.org/resources/fastqc）检查原始读段的质量。然后使用Trimmomactic（Bolger等人，2014年）从原始读段数据中修剪所有低质量和接头部分。

2.6.2 基因组组装和质量评估
在原始读段的质量评估和修剪完成后，使用SPAdes（版本2.12.1）（Bankevich等人，2012年）将读段组装成contigs。选择了“careful”选项以最小化错配和短插入/缺失的数量。组装完成后，使用QUAST（Gurevich等人，2013年）评估基因组组装的质量。随后使用Prokka（版本1.2.4）（Seemann，2014年）对组装结果进行注释。QUAST生成的组装质量指标显示平均N50为187,452 bp（范围98,216–412,875 bp），平均总组装长度为4.38 ± 0.06 Mb，每个基因组的平均contigs数量为28 ± 12个（范围12–67个）。所有组装的读段都有≥98.5%映射回最终组装。

2.6.3 物种鉴定和谱型分析
使用Kmerfinder（Clausen等人，2018年）进行物种鉴定。使用DTU CGE MLST 1.8工具（Larsen等人，2012年）进行MLST谱型分析。MLST配置设置为“Cronobacter spp.”，读段类型设置为“Illumina—paired end reads”。

2.6.4 系统发育分析
本研究使用了CSI Phylogeny 1.4工具（Kaas等人，2014年）。该工具基于SNP分析与参考基因组构建系统发育树。选择的参考基因组是监测程序中检测到的C. sakazakii序列类型4。本研究重点关注在监测期间发现的ST4分离株，因为它们与临床病例有关。为了获得高质量的封闭参考基因组，使用Nanopore DNA测序（Oxford Nanopore Technologies）对一个ST4分离株进行了测序。Nanopore测序通过监测DNA片段通过蛋白质纳米孔时的电流变化来分析长DNA片段。使用特殊的大孔尖端将未分段的DNA注入Nanopore流动池中，每个纳米孔都连接到自己的电极、通道和传感器芯片上，最终通过碱基调用算法确定序列。CSI Phylogeny 1.4（Kaas等人，2014年）运行时的参数如下：SNP位置的最小深度为10×，SNP位置的最小相对深度为0.1，SNP之间的最小距离为10 bp，SNP的最小质量为25，读段映射的最小质量为25，Z分数的最小值为1.96。只有位于至少90%的分离株覆盖的位置的SNP被考虑用于构建树。

3 结果
使用DTU CGE MLST 1.8工具进行的多基因座序列分型（MLST）分析表明，在阳性C. sakazakii样本中检测到了四种序列类型。在监测期间共检测到10个序列类型4的阳性样本。图2展示了这10个阳性C. sakazakii ST4样本的时间和空间分布。从10个ST4分离株的系统发育树（图3）中，检测到两个不同的组。分离株K08和C19非常相似（SNP差异为14个SNP，图4），与其余八个分离株差异较大（SNP差异超过660个SNP，图4）。分离株C19在3月的包装区被检测到，而第二个分离株在10月的喷雾干燥区被检测到，表明这种特定菌株虽然持续存在，但似乎没有在工艺设施的大范围内定植。图2展示了C. ronobacter sakazakii的监测采样行程和地点。图3展示了在工艺设施中回收的C. sakazakii ST4分离株的系统发育树（SNP差异见图4）。图4展示了在乳制品加工设施中回收的C. sakazakii ST4分离株的距离矩阵。相比之下，另一个包含其他八个ST4分离株的组非常相似（SNP差异小于20个SNP，图4），看起来是克隆的，并且来源于同一个污染源。如图4所示，这种菌株在监测的第一个月（12月）在喷雾干燥器的第一层被检测到，并在5月和9月零星出现。然而，在11月，该菌株在喷雾干燥器的五个不同位置被检测到，表明这种特定菌株突然大量繁殖。总之，似乎有两次独立的污染事件将ST4 C. sakazakii菌株引入了工艺设施，并被监测程序检测到。

4 讨论
值得注意的是，在总共检测到八次的ST4组中，有五次检测发生在最后的监测期间。它也在最初的监测期间被检测到，但在中间的时期只是零星出现。最后监测期间的高检测水平可能表明这种特定菌株终于开始在工艺设施的广泛区域内定植。全基因组测序（WGS）提供的分辨率显著高于之前的方法，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多基因座序列分型（MLST）。这种增强的区分能力使得能够检测到低水平的持续存在和潜在的重新污染事件，这些事件可能被忽略或被解释为与不太精确的分型技术无关的分离株。实际上，这些发现强调了有针对性的清洁和环境控制措施的重要性，特别是在已识别的高风险区域或设备缝隙中，以破坏持续存在的菌株并防止其重新出现。这种类型的空间和时间分析只有通过对阳性分离株进行测序才可能实现，证明了测序在食品加工设施中检测疫情爆发的实用性。研究表明C. sakazakii可以在乳制品加工设施中持续存在相当长的时间。其他研究也报告了C. sakazakii在乳制品设施中的持续存在。Mullane等人（2007年）使用脉冲场电泳报告说，C. sakazakii的某些克隆可能在PIF设施中持续存在，这是基于一年的监测研究。Reich等人（2010年）研究了C. sakazakii在PIF中的出现，但由于没有使用任何分子技术对回收的分离株进行分型，他们无法对工艺环境中的持续存在发表评论。Pei等人（2019年）使用脉冲场电泳和MLST研究了中国八个PIF加工设施中C. sakazakii的出现，并报告说在2年期间分离出了具有相同PFGE类型和ST类型的C. sakazakii分离株。与这些依赖于PFGE和MLST的先前研究相比，本研究中应用WGS能够更精确地识别同一序列类型内的密切相关的分离株，揭示了更精细的遗传聚类和更长期的持续存在模式。与这些先前研究相比，当前工作中使用的全基因组测序在识别相似的遗传簇方面提供了更高的精度，并且据我们所知，这是首次使用测序来追踪和识别乳制品加工环境中C. sakazakii的持续存在。然而，本研究中观察到的持续污染的来源仍然不清楚。它可能来源于设备内部一个清洁不足的常见缝隙，或者可能是通过原材料或其他外部来源反复引入的。需要进一步针对特定设备表面和进料的采样来区分这些可能性。尽管这项研究提供了有价值的见解，但仍应承认一些局限性。采样是每月进行一次，可能会错过可能在采样事件之间发生的短期污染高峰。此外，没有系统地监测或关联湿度、温度或气流等环境参数与检测事件，限制了识别潜在环境驱动因素的能力。未来包含更频繁采样和环境监测的研究将有助于解决这些差距。

5 结论
本研究成功地对爱尔兰一家大规模牛奶蛋白浓缩加工设施的环境中的Cronobacter spp.进行了为期一年的监测计划。测序和物种鉴定确认所有阳性分离株均为C. sakazakii菌株。MLST分析表明阳性分离株中存在几种序列类型。系统发育分析结合分离株的时间和空间分析表明，同一菌株至少在相当于监测期（1年）的时间内持续存在。WGS被证明是一种高效且精确的指纹识别工具，与传统的PFGE和MLST方法相比，它在追踪长期污染和特定C. sakazakii菌株的持续存在方面提供了更高的分辨率。总体而言，该研究展示了在乳制品加工设施中使用WGS作为病原体监测工作的额外指纹识别工具的实用性。这些发现强调了在乳制品加工设施中实施主动和持续的卫生监测计划的重要性，包括定期环境采样结合先进的分子工具如WGS。这些方法可以早期检测到持续存在的菌株，促进有针对性的清洁干预，并最终降低产品污染的风险。

作者贡献
郝启成：概念化、方法论、软件、数据管理、调查、验证、正式分析、初稿撰写、审阅和编辑。Francis Butler：概念化、方法论、撰写、审阅和编辑、学生指导。资金支持
本工作得到了都柏林大学学院（UCD）、爱尔兰乳制品加工技术中心（DPTC）以及中国国家留学基金委员会（CSC）的支持。利益冲突
作者声明没有利益冲突。数据可用性声明
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