《The FASEB Journal》：Stem Cell-Based Tactics for the Modeling and Treatment of Neurological Disorders
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神经系统疾病，如多样化的神经退行性疾病和神经肿瘤，对个体健康及全球经济社会医疗系统构成了重大挑战。尽管临床实践中对神经系统疾病的诊断和治疗已取得显著进展，但由于多因素病因和潜在调控网络的存在，疾病的持续复发和恶化仍是临床医生确定其确切发病机制并提出有效对策的难
神经系统疾病，如多样化的神经退行性疾病和神经肿瘤，对个体健康及全球经济社会医疗系统构成了重大挑战。尽管临床实践中对神经系统疾病的诊断和治疗已取得显著进展，但由于多因素病因和潜在调控网络的存在，疾病的持续复发和恶化仍是临床医生确定其确切发病机制并提出有效对策的难题。干细胞是具有独特的自我更新和多向分化潜能的细胞群体，广泛参与早期胚胎发育、疾病建模、药物筛选以及包括神经系统疾病在内的疾病干预。因此，它们代表了一种单独应用或结合生物工程和生物医学多层面创新的、针对难治性和复发性神经疾病治疗的新型且前景广阔的策略。在这篇综述文章中，研究人员主要概述了人多能干细胞（hPSCs）和神经干细胞（NSCs）等人类干细胞的神经分化方法、基于干细胞的神经类器官在多种神经疾病建模中的构建与应用，以及基于干细胞的治疗方案，包括用于神经退行性疾病治疗的间充质干细胞/基质细胞（MSCs）和用于神经肿瘤治疗的人多能干细胞衍生的免疫细胞（例如自然杀伤细胞、嵌合抗原受体转导的T细胞）。此外，文章还阐述了基于干细胞的策略用于神经系统疾病的前景和伴随的挑战。总体而言，本文旨在提出基于干细胞的临床前和临床研究的最新进展，以利于开发针对包括神经退行性疾病在内的神经系统疾病的新型治疗方案。
论文主体内容总结
1 引言
神经系统疾病是一组中枢和周围神经系统中神经元和小胶质细胞功能障碍或死亡的疾病，通常导致患者神经炎症和神经病理学改变，已成为全球性的严峻挑战。当前，已报道了多种神经系统疾病，如癫痫、卒中、帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）、弗里德赖希共济失调（FRDA）和神经肿瘤。多种致病因素参与其中，包括病原微生物、免疫细胞功能障碍相关的神经炎症、自噬功能障碍相关的营养代谢以及铁死亡相关的脂质过氧化。同时，研究者开发了多种体内和体外模型来再现神经系统疾病的关键结构和功能特征，如二维（2D）细胞系、患者来源的异种移植（PDX）小鼠和三维（3D）类器官。与具有显著缺点（如物种差异、耗时耗钱）的传统培养和动物模型不同，3D类器官系统更有能力在病理微环境中忠实地再现人类神经系统的细胞多样性、结构复杂性和物种特异性特征。干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的独特细胞群，包括神经谱系分化潜力，因此在神经发生、疾病重塑、药物开发和神经再生方面前景广阔。人类干细胞可分为多种亚型，如人多能干细胞（hPSCs）、多能干细胞（如间充质干细胞）和单能干细胞（如神经干细胞）。其中，hPSCs为体外神经系统疾病建模和发病机制研究提供了宝贵工具，而具有免疫调节和分泌特性的间充质干细胞（MSCs）在治疗难治性和复发性神经系统疾病方面展现出潜力。本综述文章概述了基于干细胞的策略在神经系统疾病方面的最新进展，包括干细胞向神经谱系的直接分化、用于疾病建模的3D类器官、用于疾病干预的干细胞及其衍生物，以及相关的注册临床试验。同时，文章也强调了基于干细胞的神经系统疾病研究的广阔前景和主要挑战，包括标准化与成熟、大规模生物制造、跨学科整合、伦理考量与监管政策。特别关注了hPSCs在神经系统疾病建模中的应用以及MSCs在多种神经系统疾病治疗中的应用。
2 干细胞及其衍生物用于神经系统疾病干预
2.1 缺血性卒中
缺血性卒中作为一种严重的脑血管疾病，由于其高发病率、致残性后果及有效治疗手段有限，是全球主要的健康挑战。目前，干细胞及其衍生物的进展凸显了其在治疗神经系统疾病，特别是缺血性卒中的潜力。间充质干细胞（MSCs）及其分泌的小细胞外囊泡（sEVs）作为“现货”产品，在细胞恢复和再生目的中表现出前景。脑内注射MSCs以及通过静脉等途径早期给予MSC来源的外泌体（MSC-Exos）可以减少缺血脑组织的梗死体积和神经炎症，并改善神经功能评分。MSCs通过协调细胞内和细胞间网络（如促分裂信号通路、非编码RNA、AMPK/NLRP3介导的细胞焦亡、PPARα/NFκB轴介导的小胶质细胞铁死亡）发挥多方面的调节作用。研究表明，MSCs和/或神经干细胞（NSCs）通过营养支持、促进血管再生、双向免疫调节作用、神经回路重组和神经元替代等方式，可促进缺血性卒中患者的神经功能恢复。不同于MSCs或NSCs，干细胞衍生的sEVs（如MSC-Exos）和迁移体具有多面性，可以穿过血脑屏障，并迅速逆转缺血性卒中诱导的胸腺萎缩和卒中后免疫抑制。因此，干细胞及其衍生物在卒中模型和临床实践中显示出光明的治疗前景，归因于其兼具神经保护和免疫调节的双重特性。整合多学科生物工程技术的干细胞疗法将进一步改善缺血性卒中的治疗效果。
2.2 帕金森病（PD）
帕金森病是一种致残性神经退行性疾病，主要特征为多巴胺能神经元变性、进行性运动功能障碍以及纹状体多巴胺水平降低。在发病机制上，神经黑色素积累、线粒体功能障碍、路易小体形成和活性氧（ROS）积累等多种相互关联的事件在PD的神经炎症和疾病进展中起关键作用。大量文献证实了MSCs及其衍生物对PD的治疗效果，归因于其分泌组和外泌体（MSC-sEVs）的神经再生作用以及对广泛神经炎症的双重免疫调节作用。然而，MSCs的长期低存活率仍是持续改善PD患者预后的重大挑战。为此，表达三个多巴胺合成相关基因的基因工程MSCs在PD大鼠模型移植后存活时间超过8周，并通过下调关键炎症因子（如TNF-α、IL-6、IL-10）水平和分化成功能性神经元和星形胶质细胞，改善运动功能障碍，促进多巴胺分泌。同时，研究人员致力于通过将MSCs整合到可注射生物材料（包括成熟的水凝胶）中来提高移植MSCs的存活率，进一步改善基于MSCs的方案对神经系统疾病患者的临床效果。一个含有GDNF和MSCs的超分子水凝胶通过抑制一氧化氮产生和多种促炎信号通路（如PI3K-AKT/HIF-1α、HOTAIR/miRNA-221）发挥抗炎作用。一个由MSC膜（MSCm）和中孔聚多巴胺（mPDA）纳米粒子组成的纳米系统通过清除ROS和抗炎特性发挥抗帕金森病作用。总之，神经退行性疾病治疗的进展凸显了MSCs及其分泌的生物活性物质（如MSCs-sEVs、MSC-Exos）对PD的治疗和神经修复潜力，通过与神经营养因子和具有稳定亲和力及神经保护作用的生物材料结合，进一步优化基于MSCs的治疗方案是可行的。
2.3 阿尔茨海默病（AD）
阿尔茨海默病被认为是一种炎症性神经退行性疾病，其特征是认知能力下降、毒性Aβ斑块、突触功能障碍、神经原纤维缠结（NFTs）和进行性神经退行性变。尽管临床实践取得了一定进展，但目前尚无有效的临床治疗方法或疾病修饰疗法用于AD。干细胞，特别是MSCs，由于其多向分化和抗炎特性，是AD治疗的有前景的替代方案。一项针对AD的MSC疗法的IIa期试验显示了初步的安全性和有效性，但存在某些不良事件（如头痛、发热、恶心、呕吐）。张等人报道了表达miR-146a的工程化MSC-sEVs的产生，其通过抑制NR4A3/NF-κB轴的过度激活，在AD小鼠中显示出神经保护作用并有效减轻了神经炎症。有趣的是，新型牙髓间充质干细胞（DPSCs）来源的类神经细胞（NLCs）与迷迭香酸联合使用，通过同步恢复神经网络和调节炎症微环境，在AD模型中显示出良好的疗效。当前文献提出了将先进的基因编辑系统（如CRISPR/Cas9技术）与不同亚型的干细胞（包括hPSCs、NSCs和MSCs）整合用于AD治疗的可行性。总之，基于干细胞策略的应用有力地改变了AD的治疗格局，加速了针对AD患者的个体化治疗创新，但仍需进一步探索和解决现有挑战，如长期安全性、免疫排斥和脱靶效应。
2.4 多发性硬化（MS）
多发性硬化是一种难治性的中枢神经系统慢性自身免疫性疾病，通常导致神经退行性变和残疾。在MS的疾病进展过程中，慢性区域化炎症被认为是导致皮质中衰老样小胶质细胞积累和持续临床恶化的原因。许多研究表明，基于MSC或造血干细胞（HSC）的细胞疗法对MS具有多方面的疗效，如神经保护、功能恢复和免疫调节。例如，在1期临床试验中，胎盘来源的MSCs对继发性进展型MS患者显示出免疫学（如促炎因子）和临床（如临床症状、认知和心理特征）方面的益处。此外，一项对7574项已确定研究的全面调查证实了MSCs基于其独特的免疫调节和神经保护特性对MS的治疗效果。具体而言，基于MSC的方案的短期安全性良好，但由于长期观察的局限性，其长期疗效和最佳治疗方案仍不确定。因此，进一步优化基于MSC的治疗方案（如细胞来源、剂量、频率、递送方法）和建立共识指南对MS的治疗范式至关重要。
2.5 胶质母细胞瘤
神经肿瘤包括中枢和周围神经系统的多种疾病，其中胶质母细胞瘤被认为是最具治疗抵抗性和侵袭性的脑肿瘤之一，血脑屏障（BBB）和肿瘤微环境（TME）在其发病机制和疾病进展中起着至关重要的作用。由于当前治疗方法（如手术切除和放化疗）的局限性，胶质母细胞瘤患者面临着治疗抵抗、严重不良事件、心理负担和预后不良的问题。最新的进展引入了NSCs及其分泌的外泌体通过脑内输注用于胶质母细胞瘤的治疗，这可为高级别胶质瘤患者产生神经营养因子并将溶瘤病毒治疗药物递送至TME。例如，hPSC衍生的神经祖细胞参与针对胶质母细胞瘤（GBM）的溶瘤病毒疗法。目前，NSCs通过调节多种信号通路（如ERK1/2、mTOR、p53）和释放细胞因子混合物（如TNF-α、IL-4、IL-12）的抗肿瘤作用已得到证实，这些作用共同促使免疫反应激活和胶质瘤细胞凋亡。这些发现表明，肿瘤杀伤性干细胞（如NSCs）作为有前景的递送载体用于胶质母细胞瘤治疗具有独特疗效，通过与基因修饰策略和溶瘤病毒疗法结合，进一步提高其低存活率和不足的迁移能力是有希望的。
2.6 基于干细胞的治疗临床试验
为了验证基于干细胞的治疗在神经系统疾病中的应用情况，研究人员检索了NIH的ClinicalTrials.gov网站。总体而言，共检索到258项试验，包括246项干预性试验和12项观察性试验。就注册试验的状态而言，188项已完成，23项已终止，47项正在招募中。就分布而言，美国、中国和韩国是注册临床试验数量最多的前3个国家。就细胞类型而言，应用了多种干细胞，如间充质干细胞（MSCs）、造血干细胞（HSCs）、神经干细胞（NSCs）、骨髓核细胞/干细胞（BMNCs/BMSCs），甚至iPSCs和癌症干细胞（CSCs）。同时，多种干细胞衍生物也应用于疾病干预，包括神经祖细胞、外泌体和sEVs以及条件培养基。至于iPSCs及其衍生物（如iPSC-NPCs）以及CSCs，这些细胞类型主要参与神经系统疾病的发病机制。此外，也观察到某些商业化的干细胞产品（如MSCs、NPCs、神经细胞）应用于疾病干预。神经退行性疾病、多发性硬化（MS）和脑性瘫痪是入组患者数量最多的前三类疾病，而MS、脊髓损伤（SCI）和肌萎缩侧索硬化（ALS）是注册试验数量最多的前三种疾病。这些数据反映了基于干细胞的方案在神经系统疾病研究中的多个方面。
3 干细胞向神经谱系的分化
具有多向分化潜能的干细胞是通过外胚层中间阶段产生神经细胞的独特细胞来源，包括神经干细胞/祖细胞、神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。长期研究表明，神经分化模型在模拟生理性神经发生和病理性神经系统疾病方面是可行的。
3.1 人多能干细胞（hPSCs）向神经干细胞/祖细胞的分化
人多能干细胞（hPSCs），包括人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs），为神经发育和神经系统疾病建模提供了广阔前景。已有相当数量的研究报道了将PSCs直接分化为神经上皮样干细胞（NES）、神经嵴干细胞（NCSCs）、神经干细胞（NSCs）和神经祖细胞（NPCs）。例如，从hPSCs衍生的NES是具有高表型可塑性和神经发生潜能的自我更新祖细胞群。hPSC衍生的NSCs足够分化成NPCs以及生理功能性的神经元和胶质细胞，因此在中枢神经系统修复方面前景广阔。自我组织的拟胚体（EB）或类EB聚集体模型是用于初步生成上述神经干细胞/祖细胞的高度可扩展和稳健的方法，可单独或结合生物物理和生物化学刺激（如生物反应器、小分子）使用。借助逐步分化程序和必要补充物，可以高效快速地生成NPCs和中间群体。这些程序确保了hPSCs的精确和可扩展的定向分化，从而促进了神经系统疾病建模或未来治疗，但进一步优化无需细胞分选和EB形成的有效标准程序，对于保证NSCs或NPCs的高保真重现性和高纯度是必不可少的。
3.2 人多能干细胞（hPSCs）向神经元的分化
各种亚型的不可再生的神经元在生理和病理生理信号转导中至关重要。hPSCs在促进神经再生和揭示神经退行性变和神经系统疾病过程中的神经毒性和神经保护方面具有巨大的应用前景。根据解剖学起源，通过操控外部信号和分泌的模式因子（如BMP、Wnt、FGF、Rho），可以从hPSCs产生代表性的神经元亚型，包括多巴胺能神经元、GABA能神经元、5-羟色胺能神经元、运动神经元、感觉神经元、交感神经元和副交感神经元。通过一系列中间阶段，可以从hPSCs产生多种类型的神经元，如早期外胚层特化、逐步神经谱系分化和成熟。最近，研究人员证实了3D培养相对于2D贴壁单层细胞在从hESCs逐步暴露于刺激因子混合物直接衍生功能验证的中脑多巴胺能（mDA）神经元方面的优越性。此外，3D培养系统能够从hPSCs稳健高效地产生中脑多巴胺能前体细胞（mDAPs），高纯度的mDAPs对帕金森病显示出显著的改善作用。总之，这些发现广泛证实了从hPSCs诱导功能和稳态稳定的神经元的可行性，但相关的显著缺点（如分选细胞效率低、耗时）需要通过持续的方法学优化来克服。
3.3 人多能干细胞（hPSCs）向星形胶质细胞的分化
星形胶质细胞被认为是中枢神经系统中主要的胶质细胞，在维持大脑功能和参与神经系统疾病恶化中起关键作用。从hPSCs诱导星形胶质细胞为探究人类星形胶质细胞的生理学和病理生物学提供了可行的细胞模型。几十年来，通过利用附加的星形胶质细胞生成程序，已实现从hPSC衍生的NPCs分化星形胶质细胞。如今，通过小分子或基因编辑将hiPSCs重编程为星形胶质细胞，越来越多地用于揭示人类神经系统疾病和确定治疗靶点。此外，结合单细胞RNA测序（scRNA-SEQ）分析，描绘了NFIB/SOX9诱导的hiPSCs来源的星形胶质细胞的综合图谱，以了解星形胶质细胞分化路径和分化过程中的逐步分子变化。总之，hPSCs向星形胶质细胞的分化范式促进了星形胶质细胞生成研究和与星形胶质细胞相关的神经系统疾病的发病机制研究。然而，大多数现有的诱导功能性星形胶质细胞的方法耗时较长，且是否再现了固有的发育程序尚不明确。
3.4 人多能干细胞（hPSCs）向小胶质细胞的分化
小胶质细胞是大脑中的局部胶质细胞和组织驻留的单核吞噬细胞，是监测突触和神经元活动以及神经炎症病理学的核心调节因子。通常，小胶质细胞是卵黄囊来源的巨噬细胞，通过分泌抗炎因子和吞噬外来物质，对大脑稳态和正常神经发生至关重要。对于小胶质细胞分化，hPSCs首先在Matrigel上分化为造血祖细胞，然后共同刺激指定的细胞因子混合物。与血脑屏障（BBB）功能障碍相关的先天免疫激活和血浆蛋白外渗是神经系统疾病的显著标志和新兴的治疗靶点，而小胶质细胞的持续和异常过度激活与神经系统疾病的严重程度和进展有关。例如，hiPSC来源的小胶质细胞在促炎刺激和炎症调节因子存在下表现出不同的炎症激活模式。同样，借助患者来源的hiPSCs，研究人员也确定了小胶质细胞样细胞在转录组和功能特征方面的多维变化，并阐明了小胶质细胞功能障碍在多发性硬化（MS）发病机制中的关键作用。此外，通过遗传功能缺失实验，基因消除CD11b和相关氧化应激基因可逆转阿尔茨海默病小鼠的小胶质细胞神经退行性特征。这些发现表明，患者特异性hiPSCs是剖析神经系统疾病特异性小胶质细胞过度激活和推测小胶质细胞作为潜在治疗靶点的宝贵工具。
4 基于干细胞的类器官用于神经疾病诊断
4.1 大脑类器官
对生理和病理相关的离体外脑模型的需求推动了先进的3D大脑类器官的发展，这些类器官能够忠实地再现神经功能和结构的关键方面。因此，人们开发了多种方法用于生成在细胞组成上与相应脑区相似的离体外大脑类器官。例如，采用“两步”混合2D/3D方法快速高效地构建端脑类器官，以实现多个不同脑区的同步发展和相应的区域模式化。目前，已详细阐述了人类皮质发育的生理特征以及小头畸形患者中伴随的病理性过早神经元分化。如今，人类大脑类器官或3D皮质组装体已成为研究早期神经发育、神经退行性疾病以及病毒相关神经炎症的强大替代体外模型。例如，具有LRRK2-G2019S突变的hiPSC衍生的中脑类器官强调了帕金森病中小胶质细胞神经毒性和多巴胺能神经元丢失之间的联系。同样，通过构建患者特异性类器官，证明了自闭症谱系障碍（ASD）中的神经发育改变和FOXG1依赖性GABA能神经元命运的失调。此外，大脑类器官为模拟神经-免疫轴的破坏和由此产生的神经-免疫相互作用的改变提供了极好的模型，根据神经免疫学，这些改变涉及多种神经系统疾病。总之，各种亚型的大脑类器官为研究神经系统疾病的病理生理学和分子机制提供了优势范例，例如指定小胶质细胞整合、细胞因子信号传导和先天免疫通路。然而，连接神经炎症信号通路的关键标志和神经-免疫相互作用仍有待进一步阐明。
4.2 脊髓类器官
脊髓类器官为脊髓发育、神经网络以及脊髓相关神经系统疾病的探索提供了极好的体外模型。目前，hPSCs衍生的脊髓类器官为解码中枢神经系统发育和脊髓相关疾病（包括脊髓损伤）提供了一个变革性的临床和临床前平台。例如，与3D打印支架整合的脊髓类器官从hiPSC衍生的具有背/腹模式化的区域特异性脊髓NPCs诱导而来，用于大鼠脊髓损伤干预，而将iPSC衍生的脊髓类器官封装到生物材料支架（如GelMA水凝胶）中可以进一步增强其神经再生和运动功能恢复。区别于基于传统Matrigel的方法，研究人员引入了一种新的程序，在基于脱细胞胎盘来源的细胞外基质（ECM）水凝胶上，从hiPSCs生成具有背腹组织的脊髓类器官，在促进成熟（如良好的生物相容性和层状标志物表达增强）方面表现出多方面的优势。这些方法学优化加速了hPSCs来源的类器官向神经谱系的定向分化和成熟过程，但构建具有与体内相当的结构复杂性和生理功能的脊髓类器官仍然具有挑战性。
4.3 患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）
基于原位肿瘤组织的PDTO模型保留了中枢和周围神经系统原始肿瘤的多方面特征和相应的肿瘤微环境。PDTOs有效地规避了PDX模型的多维固有局限性，特别是成本高、耗时以及与动物和人类之间肿瘤-免疫串扰的免疫相容性相关的物种特异性（如人类TME、免疫细胞相互作用）缺陷。例如，来自患者胶质瘤组织的胶质瘤大脑类器官和具有TME的新型胶质瘤类器官保持了原发肿瘤的表观遗传和遗传特征，并保留了肿瘤细胞与驻留免疫细胞之间的相互作用，同时也对化疗和靶向治疗表现出高度反应性。李等人开发了一种患者来源的原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）类器官的培养方法，该方法精确模拟了原始肿瘤的关键细胞遗传学特征，从而满足了针对个体化治疗的肿瘤间和肿瘤内异质性的临床相关性。简而言之，PDTOs为剖析免疫细胞功能障碍相关的TME中的扰动和筛选针对神经肿瘤患者的药物提供了可靠的高通量平台。同时，考虑到精准诊断和个体化治疗策略的巨大需求，迫切需要开发能够忠实保留原始肿瘤显著的肿瘤间和肿瘤内异质性以及肿瘤-免疫生态系统的新型PDTOs。
4.4 仿生器官芯片（OoC）
hPSCs衍生的3D神经类器官促进了神经发育和神经系统疾病建模，但病理条件（如信号梯度）的缺乏在一定程度上阻碍了对体内TME的忠实再现。与在微环境控制方面有局限性的类器官不同，仿生器官芯片提供了一个克服神经类器官显著缺点的新平台，从而以高保真度模拟器官水平的生理和病理。目前，已制造了多种器官芯片和多器官芯片用于神经系统疾病建模和药物测试，如大脑器官芯片、皮质器官芯片和脊髓器官芯片。例如，从hiPSCs衍生的大脑器官芯片系统可以模拟早期胎儿大脑发育的关键特征以及对产前尼古丁暴露的反应。借助多层微流控芯片，产生了多区域前脑器官芯片，它以良好的重现性反映了多个脑区的结构复杂性。与传统的3D大脑类器官相比，器官芯片模型也满足了对具有血脑屏障的神经退行性疾病的高通量药物开发和给药途径的需求。至于脊髓器官芯片模型，研究人员观察到从hPSCs产生背角
