综述：多种负责土壤中反硝化作用的微生物

《Soil Science and Plant Nutrition》：Various microorganisms responsible for denitrification in soil

　　**摘要**
反硝化作用是氮循环中的关键过程，它将硝酸盐和亚硝酸盐还原为一氧化氮、一氧化二氮（N2O）和氮气。反硝化作用也是农业土壤中氮损失和温室气体N2O排放的主要反应。近年来，关于参与反硝化的微生物的多样性、功能和生态学的研究取得了重要进展。本文综述了参与土壤反硝化的各种微生物的生态和功能特征，以及控制反硝化的技术。通过对土壤中反硝化酶亚硝酸盐还原酶（Nir）和一氧化氮还原酶（Nor）的基因组及宏基因组分析发现，反硝化细菌根据土壤性质表现出不同的生态位分化。除了典型的反硝化细菌外，土壤中还存在不进行反硝化但能还原N2O的细菌，并且已经鉴定出一氧化二氮还原酶基因（nosZ）的三个分支。此外，许多反硝化细菌仅具备部分反硝化酶，表明反硝化过程在环境中是模块化的。同时，真菌也被证实具有反硝化能力。研究人员设计了有效的引物来检测真菌的反硝化酶基因NirK和细胞色素P450一氧化氮还原酶（P450nor）。利用这些引物的宏基因组和同位素分析表明，在某些土壤环境中，真菌反硝化是主要途径。在参与碳、硫和铁循环的微生物中也发现了反硝化活性，这表明氮循环与其他生物地球化学循环之间存在耦合。尽管放线菌和古菌已被证明具有反硝化代谢途径，但仍需进一步研究以确定它们对土壤反硝化能力的实际贡献。多种控制反硝化的技术正在开发中，利用具有增强Nos活性的N2O还原细菌和大豆根瘤菌已在田间成功减少了N2O排放。此外，通过添加生物炭改善土壤物理性质也实现了N2O的减排。在实验室层面，也展示了使用化学物质特异性抑制反硝化的方法。

**关键词**：反硝化；共反硝化；自养反硝化；DNA；N2O减排

**1. 引言**
氮是影响食物生产力的最重要限制因素之一。人为来源的氮在增加作物产量以支持快速增长的人口方面起着关键作用（Smil, 1997）。在现代社会，全球近50%的粮食依赖于化学肥料生产的作物（Erisman等, 2008）。然而，大量人为氮被释放到周围土壤、水和空气中，导致了一系列环境问题（Vitousek等, 1997）。这些由人为氮引起环境问题与微生物过程密切相关（Schlesinger, 2009）。提高作物生产中氮的利用效率并减少其负面影响需要了解环境中的微生物过程（Galloway等, 2008）。土壤中的生物氮循环包括三个主要过程：矿化/分解、同化过程和异化过程（Levy-Booth, Prescott, and Grayston, 2014）。异化过程，如硝化作用、反硝化作用、亚硝酸盐还原为铵（DNRA）和厌氧氨氧化（anammox），在氮循环中起核心作用（Stein and Klotz, 2016）。这些微生物过程是氮损失和一氧化二氮（N2O）排放的主要原因。近年来，对这些过程的微生物多样性和代谢特性进行了深入研究，取得了许多新发现。反硝化作用因其在农业中的氮损失和作为温室气体N2O的主要来源而受到广泛关注，同时它也有潜力减少N2O排放（H. W. Hu, Chen, and He, 2015; J. Wang et al., 2018）。反硝化作用通常定义为在氧气有限条件下，微生物利用溶解态硝酸盐（NO3?）、亚硝酸盐（NO2?）、一氧化氮（NO）和N2O作为电子受体的呼吸作用。包括古菌、细菌和真菌在内的多种微生物都具有反硝化能力。其中一些反硝化代谢途径缺乏某些反硝化酶基因。这些多样的微生物及其完整的或不完整的反硝化途径在土壤中可能以复杂的方式相互作用，共同参与氮气和N2O的产生（Lycus et al., 2017; Tago et al., 2011）。近年来，关于土壤中这些微生物的分类多样性、代谢途径及其分子生态学的研究取得了新进展（Philippot, Hallin, and Schloter, 2007; Zhong et al., 2022）。土壤生态系统既包含具备四种氧化氮还原所需全部四种酶的完整反硝化细菌，也包含缺乏某些酶的不完全反硝化细菌（Graf, Jones, and Hallin, 2014; Pold et al., 2025）。这些发现对于理解土壤中的氮动态，特别是N2O的排放和消耗机制，以及开发控制这些气体的技术至关重要。本文综述了关于反硝化细菌、古菌和真菌的最新研究，包括它们在土壤中的生态特征、反硝化控制方法以及基于这些反硝化机制的N2O减排技术。

**2. 细菌反硝化**
多种属的反硝化异养细菌广泛分布于土壤生态系统中。通过培养依赖性和非培养依赖性方法估计，潜在的反硝化细菌占土壤细菌群落的5%（Henry et al., 2004, 2006）。已有超过60个细菌属被证实具有反硝化能力（Philippot, Hallin, and Schloter, 2007）。反硝化基因的系统发育分类并不总是与细菌的系统发育分类一致。系统发育上距离较远的细菌菌株可能携带系统发育上接近的反硝化酶，而系统发育上接近的菌株可能携带系统发育上距离较远的反硝化酶（Jones et al., 2008）。因此，对土壤中反硝化细菌的研究主要集中在反硝化基因（如nir、nor和nos基因）的多样性和丰度上，而不是它们的系统发育标记（如16S rRNA基因）。

**2.1. 反硝化酶基因**
催化从NO2?到N2O主要反应的关键酶是亚硝酸盐还原酶（Nir）和一氧化氮还原酶（Nor）。Nir分为两种进化上无关的变体：含铜的亚硝酸盐还原酶（NirK）和细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶（NirS），分别由nirK和nirS基因编码。含有NirK的反硝化细菌群落对环境因素的反应不同于含有NirS的群落，支持这两种群落占据不同生态位的假设（Graf, Jones, and Hallin, 2014; Sun and Jiang, 2022）。宏基因组组装的基因组表明，nirS型群落具有适应环境压力的代谢系统，而nirK型群落似乎适应了缺氧环境，因为它们能够利用多种碳和氮化合物（Ming et al., 2024）。生物信息学分析显示，nirK基因序列分为两个分支（I型和II型），表明大多数II型nirK序列被忽视了（Helen et al., 2016）。宏基因组分析显示，在农业土壤中，这两个分支中都存在广泛的nirK序列家族（Coyotzi et al., 2017）。类似地，nirS基因序列根据系统发育分类分为三类（I至III类），而传统的PCR引物只能检测到有限的nirS系统发育类型（Wei et al., 2015）。因此，必须重新评估环境中nir基因的多样性（Bonilla-Rosso et al., 2016; Sun and Jiang, 2022）。NirK还可能参与其他氮代谢过程，如厌氧氨氧化和硝化菌的反硝化。此外，nirK型反硝化细菌还携带nrfA和/或nirB基因，表明一个生物体内可能同时存在反硝化和DNRA的基因（Helen et al., 2016）。细菌中存在三种类型的Nor，它们分别以醌（qNOR）、细胞色素c（cNOR）或含铜的qCuANor（qNOR的电子供体为CuA）作为电子供体（Braker and Tiedje, 2003）。cNOR最常与反硝化菌群相关联，而qNOR也存在于一些能解毒NO的非反硝化微生物中（Braker and Tiedje, 2003）。通过宏基因组、宏转录组和多组学分析研究了Nor的多样性和丰度与环境因素（如土壤pH值和氧浓度）之间的关系。在一项利用PCR分析nor DNA和nor cDNA研究氧气对反硝化影响的研究中，只有少数引物对能够扩增qnor基因（B. Liu et al., 2019）。超过一半的扩增qnor DNA序列被归类为未知属，部分被鉴定为Phenylobacterium、Cupriavidus或Pseudomonas（B. Liu et al., 2019）。为了避免引物偏差（Y. Ma, Zilles, and Kent, 2019），采用了一种综合的“多组学”方法（Jansson and Baker, 2016）来分析pH值显著不同的两种土壤（pH 3.8和6.8）的宏基因组和宏转录组，结果表明qnor在酸性土壤中表达强烈，对控制NO起重要作用（Frosteg?rd et al., 2022）。

一氧化二氮还原酶（Nos）催化N2O还原为氮气，这是细菌反硝化的最后一步。Nos由nosZ基因编码，分为两个系统发育上不同的分支：I型（典型NosZ）和II型（非典型NosZ）（Sanford et al., 2012）。两种类型的Nos通过相同机制还原N2O，但在酶学性质、生理特征和生态作用上存在显著差异。不参与从NO3?到N2O催化步骤的反硝化微生物被认为是非反硝化菌，关于它们的多样性和生态学知之甚少（Jones et al., 2013; Sanford et al., 2012; Zumft and Kroneck, 2007）。随着测序微生物基因组数量的增加，具有N2O还原能力的反硝化菌和非反硝化菌的多样性被重新评估为比之前预期的更高（Hallin et al., 2018）。典型的nosZ基因编码在已充分研究的完整反硝化菌基因组上；相比之下，非典型nosZ基因不一定编码在含有nir或nor基因的基因组上。目前可用的PCR引物无法检测到的非典型nosZ序列在细菌和古菌基因组中普遍存在，并在自然环境中丰富（Jones et al., 2013, 2014）。宏基因组分析显示，在各种土壤中非典型nosZ基因的数量多于典型基因（Orellana et al., 2014）。因此，关于非典型NosZ的报道最近显著增加（Shan et al., 2021）。研究表明，非典型NosZ在土壤生态系统中N2O动态中起重要作用（X. Xu et al., 2020）。越来越多的研究指出，含有II型NosZ的细菌在土壤中N2O去除中起关键作用（Mise et al., 2025; Mitsunobu et al., 2025）。最近发现了一种新的N2O还原酶家族——III型内酯酶型N2OR（L-N2OR），其氨基酸序列与I型和II型NosZ不同，但保留了三维蛋白质结构的共同特征。宏基因组数据表明，L-NosZ存在于多种生态系统中，包括土壤、根际和水生环境，并分布于八个细菌门（G. He et al., 2025）。关于非典型NosZ在N2O减排方法中的应用的研究正在进行中（见N2O减排部分）。

**2.2. 反硝化是一个模块化过程**
单个微生物完成整个反硝化过程是例外，大多数微生物是专门执行一种或少数几种氮氧化物还原反应的专家。这一突破性观点最初由Jones等人提出（Jones et al., 2008），他们发现近三分之一的含有nir基因的基因组缺乏nos基因。随后，证实了基因组中反硝化基因（nirK、nirS和nosZ）的共存模式（Graf, Jones, and Hallin, 2014），其中nirS与nor和nosZ的共现频率高于nirK，表明nirS型反硝化菌比nirK型反硝化菌更可能完成整个反硝化过程。通过培养部分和完整反硝化菌的实验，证实了反硝化途径的模块化特性，这些细菌表现出不同的硝酸盐或亚硝酸盐代谢模式（Lycus et al., 2017; Roco et al., 2017）。最近的大规模多组学分析表明，在大多数环境微生物群落中，部分反硝化作用而非完全反硝化作用占据了主导地位，这表明反硝化代谢网络是通过整个反硝化细菌群落的协同作用来发挥功能的（Pold等人，引用2025年）。即使反硝化细菌拥有所有的氮氧化物还原酶基因，这些还原酶在不利条件下也不总是完全激活的。在这种情况下，途径的中间产物可能会与最终产物一起释放出来。例如，从耕地土壤中分离出的大多数反硝化细菌产生的最终产物是N2O和N2的混合气体，只有一小部分反硝化细菌能够将NO3?还原为N2而不释放N2O（Tago等人，引用2011年）。在土壤中，反硝化细菌处于不断变化的环境条件下，包括氧气浓度、土壤pH值、碳的可用性以及土壤中的NO3?浓度，这些因素对它们的群落组成以及反硝化和N2O的排放量具有重要影响（Gillam、Zebarth和Burton，引用2008年；H. W. Hu、Chen和He，引用2015年）。生物物质也可以改变反硝化细菌群落的活性。细菌的胞外蛋白酶（Takaki等人，引用2008年）和植物根系分泌物（Bardon等人，引用2016年；Guyonnet等人，引用2017年）会影响细菌培养物和土壤中的反硝化作用。总体而言，土壤中的反硝化活性可能由氮氧化物还原酶的活性决定，而这种活性受到从单个细胞到整个微生物群落的各种非生物和生物因素的影响。

2.3. 放线菌的反硝化作用
尽管放线菌通常被认为通过Frankia属细菌的固氮作用参与氮循环，但许多放线菌菌株也具有反硝化能力（Chèneby等人，引用2000年；Verbaendert等人，引用2011年；M. Zhang等人，引用2025年）。在放线菌中也检测到了与细菌反硝化相关的基因。许多放线菌在厌氧和/或氧气受限条件下，将硝酸盐或亚硝酸盐反硝化为N2O（Shoun等人，引用1998年），而属于Rhodococcus属的菌株则具有完整的反硝化途径，这一点通过代谢和基因组分析得到了证实（S. Ma等人，引用2022年）。此外，Rhodococcus属和Streptomycetes属细菌也参与有氧反硝化，两种Streptomyces菌株的共培养可以增强通过有氧反硝化从湖水中去除有机碳和氮的能力（B. Ma等人，引用2024年）。我们对土壤中放线菌反硝化作用的理解仍然不完整，可能存在目前尚未发现的反硝化酶。

3. 真菌的反硝化作用
虽然长期以来人们认为细菌反硝化是唯一的微生物反硝化过程，但最近发现真菌也能进行反硝化、共反硝化和氨发酵，从而扩展了呼吸作用中NO3?代谢的范围（Hayatsu、Tago和Saito，引用2008年）。真菌的反硝化作用最初由Shoun等人发现（Shoun和Tanimoto，引用1991年）。关于真菌反硝化的分子水平细节已在之前的研究中进行了综述（Hayatsu、Tago和Saito，引用2008年；Shoun等人，引用2012年）。近年来，多项研究表明真菌在土壤生态系统中产生氮气（如NO和N2O）方面起着重要作用（Zhong等人，引用2018年）。基于这些结果，现在认为真菌反硝化是陆地生态系统中N2O（一种温室气体）的主要来源，尤其是在农田中（Huang、Xiao和Long，引用2017年；Laughlin和Stevens，引用2002年；Tang等人，引用2024年）。在这里，我们讨论了真菌反硝化的生化机制，并提供了其在农业景观中的重要功能的例子。

3.1. 真菌反硝化途径
反硝化真菌包含以下酶：含铜的亚硝酸盐还原酶（NirK）和细胞色素P450作为一氧化氮还原酶（P450nor），它们将亚硝酸盐还原为N2O。这些酶位于线粒体中，并在真菌的厌氧呼吸过程中发挥作用（Kobayashi等人，引用1996年；Takaya等人，引用1999年）。真菌反硝化需要极少的氧气供应（Takaya等人，引用2003年）。基因组分析表明，nirK和p450nor（CYP55）在真菌中广泛存在（Shoun等人，引用2012年）。nirK基因的系统发育分析表明，真核生物的nirK与细菌的nirK起源于一个共同祖先（S. W. Kim等人，引用2009年；Maeda等人，引用2015年）。真菌反硝化的最显著特征是使用了P450nor（Nakahara等人，引用1993年；Takaya和Shoun，引用2000年），而细菌的一氧化氮还原则依赖于cNor或qNor。Fusarium oxysporum MT811的CYP55（P450nor）的氨基酸序列与放线菌的CYP105非常相似，这表明该真菌是通过水平基因转移从放线菌获得了P450nor基因（Shoun等人，引用2012年）。一些真菌使用两种类型的硝酸盐还原酶：同化型和非同化型硝酸盐还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后由NirK和P450nor进一步还原为N2O。然而，对于真菌反硝化来说，亚硝酸盐比硝酸盐更适宜，因为硝酸盐生成N2O的活性较低（Maeda等人，引用2015年）。同化型硝酸盐还原在植物和微生物中普遍存在，为生物合成提供氮。Cylindrocarpon tonkinase可以使用同化型硝酸盐还原酶（aNar）将硝酸盐还原为亚硝酸盐（Watsuji等人，引用2003年），而F. oxysporum则使用非同化型硝酸盐还原酶（NarGHI, dNar）（Uchimura等人，引用2002年）。在缺氧条件下，NirK和dNar参与线粒体呼吸链并产生ATP，而aNar和P450nor则作为电子受体（Shoun等人，引用2012年）。真菌的dNar和NirK蛋白可能与相应的细菌蛋白相似。

3.2. 真菌反硝化在土壤中的作用
过去30年来，人们已经认识到真菌参与自然生态系统中的氮代谢。由于真菌反硝化的最终产物N2O是一种强效的温室气体和主要的臭氧消耗物质，因此其对于土壤反硝化的贡献逐渐受到关注（Higgins等人，引用2016年）。迄今为止，已有超过100种属于60个属的真菌被证明能够产生N2O（Mothapo等人，引用2015年），表明反硝化能力在真菌中广泛存在。原位和实验室研究表明，真菌对多种土壤（包括耕地泥炭和农田）的总N2O排放有显著贡献（Yanai等人，引用2010年；Mothapo等人，引用2015年；Wei等人，引用2014年）。分子生物学方法的发展，如扩增子深度测序和宏基因组分析，提高了我们对土壤中反硝化细菌功能基因多样性的认识。用于分子研究的真菌反硝化功能目标基因包括p450nor和nirK（H. Chen和Shi，引用2017年；Higgins等人，引用2016年；Long等人，引用2015年；Y. Ma、Zilles和Kent，引用2019年）。一些研究表明，在各种土壤生态系统中，真菌反硝化对N2O的贡献显著，包括稻田（Tang等人，引用2024年）、茶田（Ji等人，引用2022年）、玉米田（H. Xu等人，引用2019年）以及一年两熟制的小麦和玉米田（J. Wang等人，引用2021年）。然而，针对nirK的1,980项全球土壤和根际宏基因组分析表明，之前对真菌反硝化的估计可能高估了其贡献，因为反硝化真菌仅占总反硝化菌群的1%（B?sch等人，引用2023年）。宏基因组学和同位素分析的结合有助于识别土壤中的微生物氮代谢途径，并估算真菌反硝化对N2O产生的贡献（Gallarotti等人，引用2021年）。

3.3. 共反硝化
共反硝化是由Shoun等人发现的一种微生物反应（Shoun等人，引用1992年；Tanimoto等人，引用1992年），定义为通过结合来自NO2?和其他氮化合物的氮原子形成N2或N2O的微生物反应。共反硝化的产物N2或N2O取决于与NO2?或NO反应的氮化合物。当存在氨基酸和苯胺等胺类物质时，会产生N2（Shoun等人，引用1992年，引用2012年）；而当存在叠氮化物、水杨酰羟胺或铵等氮化合物时，则会产生N2O（Tanimoto等人，引用1992年）。在后一种类型的真菌共反硝化中，NO的还原由P450nor催化（Su、Takaya和Shoun，引用2014年）。这意味着P450nor同时催化共反硝化和反硝化反应。在反硝化放线菌Streptomyces antibioticus B-546中也发现了共反硝化的证据，该菌可以通过反硝化和共反硝化将NO3?还原为N2（Kumon等人，引用2002年）。目前，已知（或至少假设）几种细菌和古菌也具有共反硝化能力，但它们的个体共反硝化能力差异很大（Spott、Russow和Stange，引用2011年）。尽管共反硝化是一个公认的微生物过程，但由于以下三个原因，评估其对田间环境的贡献仍然困难：Anammox也可以在缺氧条件下利用NH4+和NO2?（或NO3?）通过N2O生成N2（Long等人，引用2013年），尽管其在土壤氮循环中的贡献被认为较小（Hayatsu、Katsuyama和Tago，引用2021年）。由于财务和方法上的限制，氮的排放过程及其程度仍不清楚（Selbie等人，引用2015年）。土壤中的NO2?和NO浓度通常很低，且由于有机和无机形式之间的氮转化途径复杂，许多关于土壤中共反硝化底物的方面仍然未知（Spott、Russow和Stange，引用2011年）。尽管如此，最近的研究提供了土壤中共反硝化的证据（Clough等人，引用2017年；Harris等人，引用2021年；Selbie等人，引用2015年），并表明真菌是共反硝化产生的N2和N2O的主要微生物来源（Laughlin和Stevens，引用2002年；Long等人，引用2013年）。

4. 反硝化与其他生物地球化学循环的相互作用
生物地球化学循环通常被单独研究；然而，它们是共同进化并相互影响的。氮循环与许多其他生物地球化学（元素）循环（如碳、硫、氢和铁循环）紧密相关。本章概述了与土壤生态系统中反硝化相关的微生物反应。

4.1. 甲烷氧化
在荷兰受到高氮负荷农业径流影响的缺氧淡水沉积物中（Raghoebarsing等人，引用2006年）以及澳大利亚的沉积物和污泥混合物中（S. Hu等人，引用2009年），发现了将甲烷氧化为二氧化碳的微生物群落，这一过程与反硝化同时发生。这种由硝酸盐驱动的甲烷厌氧氧化（AOM）为微生物氮循环和碳循环提供了独特的联系。该微生物群落主要由属于2d谱系的厌氧甲烷氧化古菌（ANME-2d）和属于NC10门的细菌组成，两者都能独立进行甲烷氧化。ANME-2d谱系的古菌“Candidatus Methanoperedens nitroreducens”可以通过使用硝酸盐作为最终电子受体进行厌氧甲烷氧化（方程1）（Haroon等人，引用2013年）。“Ca. M. nitroreducens”含有硝酸盐还原基因（narH和narG），但不包含后续的反硝化步骤，因此不参与这一反硝化反应：
CH4 + 4NO3? → CO2 + 4NO2? + 2H2O (ΔG°’ = ?503 kJmol?1 CH4) (1)
属于NC10门的细菌“Ca. Methylomirabilis oxyfera”可以在硝酸盐存在下完成从亚硝酸盐到N2的反硝化；然而，其基因组不编码Nos基因（方程2）。“Ca. M. oxyfera”通过歧化酶直接将NO还原为N2和O2，后者用于自身的甲烷氧化（Ettwig等人，引用2010年）：
3CH4 + 8NO2? + 8H+ → 3CO2 + 4N2 + 10H2O (ΔG°’ = ?928 kJmol?1 CH4) (2)
从稻田土壤中分离出的“Ca. Methylomirabilis sinica”具有完整的反硝化代谢途径，并使用硝酸盐作为电子受体产生氮气（方程3）（Yao等人，引用2024年）：
5CH4 + 8NO3? + 8H+ → 5CO2 + 4N2 + 14H2O (ΔG°’ = ?765 kJmol?1 CH4) (3)
AOM在稻田和湿地表面土壤中广泛存在（G. Zhu等人，引用2018年），但其对当地氮循环的影响较小。已经从各种生境中获得了AOM的16S rRNA基因，包括自然淡水湿地土壤（Shen等人，引用2015年）。此外，通过培养技术成功获得了以“Ca. M. nitroreducens”或接近“Ca. M. oxyfera”的NC10门细菌为主的富集培养物（Z. He等人，引用2016年；Vaksmaa等人，引用2017年，中国和意大利）。因此，甲烷的厌氧氧化与反硝化结合在生态系统中被认为具有重要意义。某些甲烷氧化细菌可以利用甲烷作为电子供体进行反硝化。甲烷驱动的反硝化在碳循环和氮循环之间起着重要的桥梁作用（J. Zhu等人）。2016年的研究特别指出，在有氧和无氧环境共存的区域，如湿地和稻田中，这一过程尤为明显（K.-H. Chen等人，2024年引用）。4.2. 自养反硝化作用与异养反硝化作用不同，异养反硝化利用有机化合物作为电子供体，包括低分子量和高分子量的有机化学物质，而自养反硝化则使用超过12种无机化合物作为电子供体，包括氢气（H2）、还原态硫化合物（硫化物、单质硫、硫代硫酸盐等）、亚铁（Fe2+）、硫化铁（FeS、Fe1?xS、FeS2等）、亚砷酸盐（As(III)）和锰（Mn(II)）（Di Capua等人，2019年引用；Pang和Wang，2021年引用；I. Zhu和Getting，2012年引用）。本节概述了依赖铁和硫的自养反硝化作用，这种作用已在土壤中得到证实，并有大量观察报告。硫在环境中很常见，约占地球地壳的0.1%。硫循环主要由微生物的氧化和还原反应驱动，其中一些反应与其他生物地球化学循环（如碳和氮的循环）密切相关（Zhou等人，2025年引用）。基于硫的反硝化作用利用还原态硫化合物（S2?、S0和S2O32?）作为电子供体，氧化态氮化合物作为电子受体。这种反硝化作用更倾向于发生在富含这些化合物的环境中，例如热液喷口、海洋沉积物和污水处理厂，而不是农业土壤中（Shao、Zhang和Fang，2010年引用）。然而，由Sulfuricella denitrificans主导的基于硫的反硝化作用也在流域溪流中的富硫土壤层中被观察到（Hayakawa等人，2021年引用）。这表明，依赖硫的反硝化作用可能会影响氮循环，具体取决于土壤中的硫含量和土壤性质。铁（Fe）是几乎所有生物必需的元素，也是地壳中第四丰富的元素（Kappler等人，2021年引用；Melton等人，2014年引用）。微生物的铁(II)氧化与硝酸盐还原（硝酸盐依赖的Fe(II)氧化；NDFO）过程已知已有约30年的历史（Straub等人，1996年引用）。NDFO在厌氧条件下已在稻田土壤（Grimm等人，2025年引用）和沉积物（Schaedler等人，2018年引用）中被发现。NDFO由系统发育上多样的细菌催化，其过程分为自养反硝化、混合营养反硝化和化学反硝化（Bryce等人，2018年引用；Picardal，2012年引用）。自养NDFO细菌利用Fe(II)作为电子供体来产生能量并固定二氧化碳（CO2），从而构建其生物量。从稻田土壤中高度富集的岩养自养铁(II)氧化菌Galionella可以将铁(II)氧化并还原为N2O（Grimm等人，2025年引用）。混合营养NDFO需要有机底物作为额外的碳或能量来源，以促进Fe(II)的氧化，同时伴随硝酸盐的还原。有趣的是，He等人（2016年引用）在淡水沉积物中的化能自养NDFO细菌群落中观察到了完全的反硝化作用。在这些群落中，Galionellaceae是主要的Fe(II)氧化菌，并与反硝化菌合作，以避免Galionellaceae产生的有毒代谢物NO的积累。尽管NDFO是一种可以增加某些细菌生长产量的生物过程，在评估实验结果时应考虑化学反硝化反应（如非生物NDFO反应）（Bryce等人，2018年引用）。自养反硝化菌的分子、生物学和生态学特性仍不清楚，因此它们对生态系统反硝化活动的贡献尚不清楚。然而，对这些微生物的研究表明，氮循环与铁和硫循环有关，可能揭示它们对生态系统氮转化的影响。5. 6. 古菌反硝化虽然关于古菌反硝化的了解不如细菌反硝化多，但已有研究表明某些古菌具有反硝化能力（Cabello、Roldan和Moreno-Vivian，2004年引用；Torregrosa-Crespo等人，2018年引用）。古菌反硝化的遗传和生化研究主要集中在极端嗜好古菌成员上（Baliga等人，2004年引用；Torregrosa-Crespo等人，2017年、2018年引用）。对卤古菌成员反硝化相关基因和基因组数据的生物信息学分析表明，完全反硝化表型在Haloarculaceae和Haloferacaceae家族中较为常见，而在Natrialbaceae和Halorubraceae家族中则较少见（Miralles-Robledillo等人，2021年引用）。一些卤古菌，如Haloferax denitrificans、Haloferax mediterranei和Haloarcula marismortui，能够将硝酸盐还原为N2。在某些情况下，它们还会释放N2O（Bonete等人，2008年引用；Zumft和Kroneck，2007年引用）。H. marismortui的基因组编码narGH、nirK和nosZ，表明该菌株具有完整的反硝化途径（Baliga等人，2004年引用；Ichiki等人，2001年引用；Yoshimatsu、Iwasaki和Fujiwara，2002年引用）。该菌株至少含有40个可能与反硝化过程相关的基因（Baliga等人，2004年引用）。相比之下，Natrinema sp. J7-2的基因组中编码nirK和norB，但不编码nar和nos基因，表明该菌株的反硝化途径不完整，只能通过NO将亚硝酸盐还原为N2O（Feng等人，2012年引用）。比较基因组分析表明，醌依赖的呼吸型一氧化氮还原酶（qNor）是卤古菌中一氧化氮还原的关键酶（Torregrosa-Crespo等人，2017年引用）。卤古菌的Nar与细菌的Nar不同，其区别在于亚基组成、活性位点的亚细胞位置和基因组织（Bonete等人，2008年引用）。此外，显著参与土壤硝化作用的氨氧化古菌（AOA）也在分离菌株（Kerou等人，2016年引用）和土壤宏基因组分析（Long等人，2015年引用）中被发现含有亚硝酸盐还原酶基因（AnirK）。微宇宙培养实验表明，湿地和稻田土壤中AnirK基因的转录活性显著高于细菌的nirK和nirS基因（B. Han等人，2022年引用）。检测到的AnirK基因存在于沿海沉积物中的Nitrosopumilus和稻田及湿地中的Candidatus Nitrosoarchaeum基因组中。AOA也参与土壤中的反硝化和N2O的产生。尽管遗传和生化研究提供了古菌反硝化过程的分子细节，但在大多数情况下，仍不清楚古菌群落的实际反硝化活性及其在自然界的角色。未来的研究应重点关注这些基因在生理和生态水平上的产物。7. 不同形式的硝酸盐还原为氨（DNRA）DNRA是另一种还原硝酸盐的过程。DNRA在各种厌氧环境中发生，如土壤和水体，由包括细菌、古菌和真菌在内的多种微生物催化，利用有机化合物、氢气、亚铁和硫化物作为电子供体（Zhao等人，2025年引用）。DNRA被称为“生物氮循环中的短路”，因为NO3?和NO2?直接转化为NH4+，绕过了反硝化和氮气固定过程（Rütting等人，2011年引用）。与反硝化相比，DNRA的潜在自由能较低（完全反硝化，ΔG°‘= ?2669 kJmol?1葡萄糖；DNRA，ΔG°‘= ?1796 kJmol?1葡萄糖）（Rütting等人，2011年引用），但在强还原条件下，每摩尔亚硝酸盐可以转移更多的电子（反硝化，2或3个电子；DNRA，6个电子）（Mohan和Cole，2007年引用）。硝酸盐转化为氨可以通过细胞质和/或胞质外途径实现，具体取决于微生物和生长条件（Mohan和Cole，2007年引用）。在细胞质途径中，Nar和胞质NADH依赖的亚硝酸盐还原酶NirB（或其双亚基变体NirBD）分别催化NO3?和NO2?的还原。在胞质外途径中，Nap和五血红素细胞色素c亚硝酸盐还原酶NrfA分别参与NO3?和NO2?的还原。定量测量DNRA活性的最常用和可靠方法是使用15N稳定同位素示踪技术的土壤培养实验。结合针对DNRA相关基因（如nrfA）的分子生态学方法，可以进行更详细的分析（Pandey等人，2020年引用；Putz等人，2018年引用）。尽管长期以来反硝化被认为是土壤中主要的硝酸盐还原过程，但最近的研究开始更多关注土壤中的DNRA，因为其在森林、农田和稻田等环境中的贡献不可忽视（Z. Chen等人，2015年；Cheng等人，2022年；Putz等人，2018年；Yin等人，2011年）。多种环境因素，包括土壤pH值、C/N比、电子供体/电子受体（C/NO3?）比、硝酸盐限制和碳底物，都会影响DNRA（Cheng等人，2022年；Putz等人，2018年；Schmidt、Richardson和Baggs，2011年）。越来越多的证据表明N2O是通过DNRA产生的（Rütting等人，2011年）。DNRA细菌产生N2O的机制被认为是氮氧化物的解毒机制（即NO2?和NO）。大肠杆菌中的DNRA伴随着NO的形成，而NO随后被还原为N2O（Spiro等人，2011年）。生化实验表明NrfA和NirB参与NO的产生（Corker和Poole，2003年）。产生的NO随后通过其他反应进一步还原为N2O（Helen等人，2016年），以避免高浓度的NO。尽管DNRA具有产生N2O的能力，但其对生态系统N2O排放的实际贡献仍不清楚。先前的元分析表明DNRA活性与N2O排放呈负相关（Cheng等人，2022年）。土壤微宇宙实验（Z. Chen等人，2015年）和田间实验（Putz等人，2018年）表明，DNRA活性与反硝化在硝酸盐获取方面存在竞争，这意味着较高的DNRA活性会减少反硝化产生的N2O排放。然而，由于DNRA和反硝化都受土壤化学和物理性质的影响，这两种途径之间的竞争取决于具体的生态系统。因此，需要进一步研究DNRA对N2O排放的贡献。8. 反硝化对一氧化二氮排放的贡献土壤中的一氧化二氮排放涉及以下四种主要途径：自养硝化作用将NH4+转化为氮（Prosser等人，2020年）、异养硝化作用将有机氮转化为氮（Gao等人，2023年；J. Zhang、Mueller和Cai，2015年）、反硝化作用将NO3?转化为氮（Philippot、Hallin和Schloter，2007年）以及NO3?和有机氮的共同反硝化（Spott、Russow和Stange，2011年；Tanimoto等人，1992年）。在中国多个茶种植区观察到N2O排放强度和途径存在显著差异。共同反硝化和异养硝化是N2O排放的主要来源，分别占总排放量的34%和41%。然而，平均而言，反硝化和自养硝化仅分别贡献22%和3%（Tu等人，2025年）。对74篇论文中的1,315个土壤N2O观测数据集的元分析显示，全球范围内硝化作用产生的N2O排放量超过了反硝化作用。然而，不同陆地生态系统中的硝化作用产生的N2O与反硝化作用产生的N2O的比例存在显著差异（B. Han等人，2024年）。这种差异被认为是由多种化学和物理土壤性质以及土壤管理和施肥条件引起的。例如，元分析表明，提高土壤pH值会使N2O排放从以反硝化为主转变为以硝化为主（Ge等人，2024年）。实验室和田间规模实验表明，产生N2O的途径取决于土壤含水量（H. Wang等人，2023年）、pH值（G. Wu等人，2024年）和有机肥料（J. Wang等人，2023年）。因此，准确确定每种微生物N2O排放途径对总N2O排放的定量贡献是困难的。然而，有报告指出，残留作物可能是N2O排放的来源（Akiyama等人，2016年；Itakura等人，2012年；K. Kim等人，2021年；Kravchenko等人，2017年）。Tago等人（2026年）报告称，残留作物的地上部分是农田中N2O排放的热点，栖息在衰老叶片中的反硝化细菌利用叶片中的硝酸盐和有机物产生N2O。虽然反硝化通常被认为是厌氧过程，但反硝化细菌即使在空气包围的叶片表面也能产生N2O。这些结果表明，反硝化的生态位从地下土壤延伸到地上植物。9. 用于减少一氧化二氮的反硝化控制策略土壤中的反硝化是由上述多种反硝化反应组成的复杂代谢过程驱动的。这些关键反应会随着环境因素（如土壤温度、湿度和可利用的碳、氮和氧的数量）的变化而变化（Li等人，2022年）。因此，直接控制主导的反硝化细菌是困难的，因为这些细菌会随着土壤环境的变化而变化。已有方法通过控制影响反硝化的环境因素来减少N2O的产生，这些方法包括各种传统的田间管理实践。然而，关于影响土壤反硝化速率的环境因素的全球评估以及减少这些因素的技术尚不充分。一项使用225项研究（3367个观测数据）的荟萃分析表明，土壤反硝化速率随着土壤含水量（WFPS）、硝酸盐（NO3?）含量和土壤温度的增加而增加（p < 0.05）（Pan等人，Citation2022）。另一项针对214项研究（4301个观测数据）的关于陆地生态系统的荟萃分析表明，土壤氮含量和微生物生物量是全球范围内反硝化的强大预测因子（Li等人，Citation2022）。为了抑制土壤反硝化、减少氮损失并提高氮利用效率，已经进行了多种田间和实验室研究，证明了基于铵的肥料（Rahman和Forrestal，Citation2021）、生物炭的应用（Z. Wu等人，Citation2023）以及使用硝化抑制剂（Q. Wang等人，Citation2017）的有效性。本节概述了三种目前备受关注的N2O去除技术：利用具有NosZ I的反硝化细菌和具有NosZ II的非反硝化细菌；通过改善微生物N2O还原条件来增强生物炭的效应；以及使用化学抑制剂来抑制反硝化。

9.1. 微生物对一氧化二氮的缓解
如上所述，反硝化细菌被分为完全反硝化细菌（拥有反硝化途径中的所有四种酶）和不完全反硝化细菌（拥有三种或更少的酶）。具有多种反硝化酶（包括NosZ）的反硝化细菌既可以作为N2O的来源，也可以作为其汇。相比之下，仅具有NosZ的反硝化细菌则主要作为N2O的汇。最近的证据表明，在实验室和田间尺度上，反硝化细菌和非反硝化细菌都能减少N2O的排放。
在作物生产过程中，农田土壤中保留的大量作物残余物显著影响了土壤中的N2O排放（Olesen等人，Citation2023）。大豆约占全球耕地总面积的8%，老化及腐烂的根瘤释放的氮成为土壤中N2O的来源（FAO，Citation2024）。大豆中的代表性固氮根瘤菌具有反硝化途径，其土壤中既存在nosZ阳性菌株（具有nosZ的菌株），也存在nosZ阴性菌株（缺乏nosZ的菌株）（Shiina等人，Citation2014）。用人工增强nosZ活性的Bradyrhizobium diazoefficiens菌株或从土壤中分离出的天然高nosZ活性菌株接种大豆种子，可以减少根瘤分解过程中的N2O排放（Akiyama等人，Citation2016；Itakura等人，Citation2008；Melissa等人，Citation2022）。然而，由于与土壤中本土根瘤菌群的竞争，这些高nosZ活性菌株的接种往往无法有效减少N2O排放。最近，提出了一种新的策略，通过修改大豆和根瘤菌的宿主特异性遗传决定因素来解决这一问题（Nishida等人，Citation2025；Sugawara等人，Citation2018）。通过杂交育种培育出能够积累抑制本土根瘤菌感染的不相容基因的大豆品系。同时，通过诱导自发突变产生了具有高Nos活性的B. ottawaense菌株。这种改良的宿主与选定的根瘤菌菌株的协同应用确保了共生优势，并成功实现了有效的N2O减排。
具有II类NosZ的细菌，即非反硝化细菌，被认为仅在土壤中作为N2O的汇。事实上，接种携带II类nosZ的非反硝化细菌已被证明可以减少土壤中的N2O排放（Domeignoz-Horta等人，Citation2016）。然而，利用这些微生物减少N2O的技术需要分离出能够在土壤中维持其种群并发挥作用的非反硝化细菌，并开发出适用于大规模种植的成本效益方法。Hiis等人（Hiis等人，Citation2024）报告了一种突破性方法，满足了非反硝化细菌实际应用的条件。为了获得在污水处理厂的厌氧消化和土壤中均具有活性的非反硝化细菌，他们开发了一种“双重富集策略”，交替使用经过灭菌的沼气反应器消化物和土壤作为生长基质，并提供N2O（Jonassen等人，Citation2022）。通过这种方法分离出的Cloacibacterium sp CB-01菌株含有II类NosZ，在所有测量的N2O还原菌株中表现出平均的N2O还原活性。然而，该菌株在无菌消化物中有较高的细胞密度，并且在氧气浓度降低时立即表现出N2O还原活性。当这种菌株在同时作为营养源和载体的消化物中生长并应用于农田时，N2O排放量成功减少了50-90%。

9.2. 生物炭
将生物炭施用于土壤可以改善其物理和化学性质，包括持水能力（Adhikari、Timms和Mahmud，Citation2022）、团聚体稳定性（Situ等人，Citation2022）、土壤pH值（Chintala等人，Citation2014）和阳离子交换能力（Domingues等人，Citation2020）。此外，据报道生物炭通过影响参与氮循环的微生物群落结构和活性来抑制N2O排放（Harter等人，Citation2014；X. Liu等人，Citation2021）。已经提出了几种利用生物炭抑制N2O产生的机制。添加生物炭可以提高土壤pH值，从而通过促进表达NosZ的细菌种群的生长来增强N2O还原活性（Aamer等人，Citation2020；Obia等人，Citation2015）。荟萃分析表明，生物炭的应用增加了nosZ基因的丰度，并使N2O排放量减少了约30%至50%，尽管具体影响取决于土壤类型和性质（如含水量及生物炭生产条件）（Zhong等人，Citation2025）。生物炭作为电子穿梭体，通过提高反硝化最后一步——N2O还原为N2的电子转移效率来加速反硝化过程（Yuan等人，Citation2019）。上述基于生物炭的N2O减排技术的有效性取决于所使用的生物炭特性、土壤特性、种植作物和土壤管理措施（Kaur等人，Citation2023）。

9.3. 化学反硝化抑制剂
针对反硝化途径中酶的化学物质尚未商业化；然而，已经鉴定出一些有效的化学物质。某些植物分泌到根际的黄酮类物质原花青素可以抑制土壤中的反硝化细菌，这种现象称为生物反硝化抑制（BDI）（Bardon等人，Citation2014）。研究表明，原花青素通过改变膜结合型NO3?还原酶的构象而发挥别构抑制作用（Bardon等人，Citation2016）。微宇宙实验表明，无论施用哪种类型的氮肥，原花青素都能抑制反硝化活性；然而，抑制效果取决于氮肥类型，在施用NH4NO3的土壤中，原花青素对反硝化的抑制作用更为显著（Ye等人，Citation2022）。土壤微宇宙实验显示，原花青素显著减少了茶田高酸性土壤中由肥料产生的N2O排放量（X. Han等人，Citation2025）。原花青素在高酸性土壤中更有效地减少N2O排放，因此它是可持续茶田的理想改良剂。通过结合药效团建模和分子对接的层次化计算机筛选，选出了真菌亚硝酸盐还原酶抑制剂。嘧啶酮和三嗪酮在体外和体内评估中均抑制了F. oxysporum的NirK活性（Matsuoka等人，Citation2017）。这些化学物质可能有助于开发针对真菌反硝化的抑制剂，防止氮损失并控制N2O排放。此外，将野生玉米近缘种teosinte（Zea mays ssp. parviglumis）中控制生物硝化酶和反硝化酶（BNIs和BDIs）分泌的基因引入栽培玉米，显示出调节根际氮转化的巨大潜力（Favela等人，Citation2026；Favela、Bohn和Kent，Citation2025）。

10. 结论
包括宏基因组学、同位素分析和高精度田间气体测量在内的研究方法的发展，使我们能够深入了解反硝化微生物，这些成果总结在本综述中。这些进展显著提高了我们对细菌、古菌和真菌反硝化过程的理解。此外，还提出了利用减少一氧化二氮的微生物或抑制反硝化酶的化学物质来控制反硝化的新技术，并在田间环境中验证了其有效性。然而，关于这些微生物在不同土壤环境中的多样性和生态学特性，以及构成反硝化途径的酶，仍有许多未知之处。关于真菌、放线菌和古菌的反硝化机制的知识仍然非常有限。即使在细菌反硝化领域，也存在许多未解之谜；例如，与III类NosZ相关的新型酶——一种关键的一氧化二氮减排酶——也是最近才发现的。为了在多种环境中有效管理反硝化微生物，需要进一步整合生理学、生物化学和酶学的研究。此外，还需要研究土壤团聚体结构（它对氧气供应和含水量具有关键影响，而这些因素对反硝化至关重要）如何影响反硝化微生物。

手稿分类：3. 土壤生物学
贡献类型：简短综述