由磁性RNA构建块（RBBs）驱动的模块化球体组装

《Biomaterials》：Magnetic RNA Building Blocks (RBBs)-driven Modular Spheroid Assembly

金京雅（Kyung A. Kim）| 池允斌（Yoonbin Ji）| 文成铉（Sunghyun Moon）| 张一秀（Iksoo Jang）| 李钟彬（Jong Bum Lee）

首尔大学化学工程系，韩国首尔02504

摘要

开发生理相关性的三维（3D）细胞培养平台对于推进组织工程、疾病建模和药物筛选至关重要。然而，传统的球形体制备方法在可重复性、结构调控和生物相容性方面存在持续挑战。在这里，我们提出了一种基于磁性RNA构建块（RBBs）和含有叠氮基团的细胞构建块（CBBs）的模块化球形体组装策略，实现了可编程和生物正交的三维多细胞结构的构建。RBBs通过在Mn²⁺存在下进行滚环转录合成，形成了基于RNA的纳米结构。引入DBCO修饰的核苷酸后，可以与CBBs发生叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC），从而高效且快速地形成球形体。所得球形体具有均匀的三维结构、高存活率，并且在多种细胞类型中表现出优异的生物相容性。此外，通过二次点击化学进行模块化组装还可以实现异型球形体的整合和磁空间控制，模拟复杂的组织微环境。重要的是，这些磁性支架在生理还原条件下可完全降解，组装后无需残留。这种多功能、可调节且可生物降解的基于RNA的平台为构建磁性可控的异型球形体提供了强大解决方案，推动了下一代3D培养系统的发展。

引言

近年来，三维（3D）细胞培养技术已成为医学和生物技术中不可或缺的工具，能够提供更接近体内环境且复杂的生物反应的生理相关环境。传统的二维（2D）细胞培养方法在充分反映细胞间相互作用和复杂微环境方面存在固有局限性。为了解决这些局限性，出现了诸如球形体和类器官等先进的3D培养平台[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。特别是球形体是通过自组装形成的球形细胞聚集体，通常采用悬浮培养、低附着表面或微孔板等方法制备[11]、[12]。它们特别适用于通过促进细胞间相互作用来模拟肿瘤微环境和药物反应。另一方面，类器官是通过干细胞的自我组织来重现特定器官的结构和功能特征的3D培养物，主要通过在细胞外基质（ECM）如Matrigel中培养细胞来实现，为研究器官发育[13]、[14]、[15]、疾病病理[16]和个性化药物筛选[18]、[19]、[20]提供了平台。

尽管3D细胞培养技术取得了显著进展，但目前用于生成球形体的方法仍面临若干关键限制[21]、[22]。首先，实现均匀性和可重复性仍是一个重大挑战。尤其是球形体自组装的复杂性常常导致尺寸、形态和细胞组成的显著异质性。其次，ECM的物理和化学性质难以控制，营养和氧气扩散受限常常导致中心坏死[23]、[24]、[25]。为了克服这些限制，人们正在积极探索各种生物材料和工程方法[26]、[27]、[28]。其中，核酸纳米结构作为构建3D球形体的工具展现出巨大潜力[29]，这归功于其出色的生物相容性、可生物降解性以及在纳米尺度上控制结构的能力[30]。然而，在精确调整细胞组装的形状和组织结构方面仍有很大改进空间。

在这里，我们介绍了一种基于RNA构建块（RBBs）和基于细胞的构建块（CBBs）的稳健模块化球形体组装平台，作为构建球形体的可编程、模块化支架单元（图1）。该策略的关键特点是使用离散的、经过工程改造的RBBs和CBBs作为可互连的模块化单元。这种模块化设计还使得球形体的最终结构可以通过设计模块化单元的组合来精确预测和控制。此外，通过在RBBs上引入磁性特性，可以外部引导组装过程，实现对模块化单元的精确导向，形成复杂的预定义结构。值得注意的是，我们的平台利用了生理条件下的RNA合成过程，与传统磁性颗粒相比具有更好的细胞相容性。磁性RBBs的合成是通过使用环状DNA模板和T7 RNA聚合酶进行的酶介导的滚环转录（RCT）驱动的（图1A）[31]、[32]、[33]、[34]。这一连续扩增过程产生的焦磷酸（PPi^4-）与Mn²⁺离子反应形成锰焦磷酸盐（Mn₂P₂O₇）复合物[34]、[35]、[36]、[37]、[38]，这些复合物赋予生成的RNA产物内在的磁性[39]、[40]、[41]。此外，在转录过程中引入DBCO修饰的核苷酸可以通过叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）实现细胞偶联[42]、[43]、[44]。由此产生的磁性RNA构建块（RBBs）可以选择性地与含有叠氮基团的细胞结合，从而快速且特异性地形成高保真的3D球形体。为了实现选择性细胞偶联，细胞首先在添加了叠氮同型丙氨酸（AHA）的甲硫氨酸缺乏培养基中培养，这会将叠氮基团引入膜蛋白[45]、[46]。随后，这些含有叠氮基团的细胞（AzPCs）作为基于细胞的构建块（CBBs）通过点击化学快速且特异性地与RBBs结合，形成稳定的球形体组装基础（图1B）。

与磁性RBBs偶联的CBBs可以利用外部磁场进行精确导向和对齐，从而实现精确且可重复的球形体组装。RBBs的磁性特性允许进行空间图案化并增强结构控制（图1C）。此外，点击化学的模块化特性使得多种细胞类型的共组装成为可能，从而形成模仿天然组织细胞异质性的异型球形体[47]、[48]、[49]。这些多细胞结构提供了比单一细胞类型组成的模型更接近生理环境的模型。值得注意的是，与传统磁性纳米粒子系统[50]、[51]不同，磁性RBBs在球形体形成后可以通过谷胱甘肽触发的生物降解选择性地去除，减轻了残留磁性材料的担忧[52]、[53]、[54]、[55]。此外，RNA支架还为基因编辑载体的装载[56]和治疗功能提供了可能性[57]、[58]。作为一种生物相容、磁性可控且可扩展的3D细胞培养平台，模块化球形体组装为疾病建模、再生医学和高通量药物筛选等多种应用提供了有前景的策略。

节选内容

材料和试剂

所有DNA寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies（IDT）。线性DNA链的序列如下：5’-phosphate - ATA GTG AGT CGT ATT AAC GTA CCA ACA AAT GTG AAT GCA GAC CAA AGA ATT ACT TGA ATT CTT TGG TCT GCA TTC ACA TTT TAG AGG CAT ATC CCT-3’。引物DNA序列为5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA T -3’。T4 DNA连接酶购自Promega（美国麦迪逊）。T7 RNA聚合酶和核苷酸溶液混合物购自New

RBBs的磁响应性和结构特征

为了研究结构形态，通过滚环转录（RCT）合成的产物使用扫描电子显微镜（SEM）进行了分析。所得图像显示了一种类似Hasselback的结构，其特征是平均直径约为8 μm的堆叠纳米层（图2A）。透射电子显微镜（TEM）图像显示RBB颗粒的内部结构由层次化的纳米层组成，与观察结果一致

结论

在这项研究中，我们介绍了一种基于RNA构建块和细胞构建块的模块化、磁性响应且生物正交组装的球形体平台，能够实现具有精确结构和功能控制的可编程3D多细胞结构。与传统依赖自发聚集或静态ECM支架的球形体制备方法不同，我们的系统提供了动态的、可调节的、定向引导的组装方式，并具有模块化扩展性。

CRediT作者贡献声明

金京雅（Kyung A Kim）：撰写——原始草稿、可视化、方法论、数据分析、概念化。池允斌（Yoonbin Ji）：撰写——原始草稿、方法论、数据分析。张一秀（Iksoo Jang）：可视化、方法论。文成铉（Sunghyun Moon）：验证、数据分析。李钟彬（Jong Bum Lee）：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念化

伦理批准和参与同意

所有动物均按照美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南接受了适当的护理。该研究方案已获得韩国大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号：KUIACUC-2022-0032）。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

评估论文结论所需的所有数据均包含在论文和/或补充材料中。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）[RS-2022NR070138]和[RS-2025-02217898]的资助，以及韩国健康技术研发项目（KHIDI）通过韩国卫生福利部（MSIT）[RS-2024-00437312]的资助。