从阿拉伯胶中提取的纯化阿拉伯半乳聚糖显示出免疫调节作用，能够促进RAW 264.7巨噬细胞产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），并降低IL-17A的水平

《Food Hydrocolloids for Health》：Purified arabinogalactan from Gum Arabic demonstrated immunomodulatory effects by producing GM-CSF and reducing IL-17A levels in RAW 264.7 macrophages

　　崔丽林|陈伟琳|林佳瑜|杨朝勋
台湾台中市433303，普罗维登斯大学化妆品科学系

**摘要**
阿拉伯胶是一种常用的乳化剂和稳定剂，当与干扰素-γ（IFN-γ）协同作用时，会增强巨噬细胞的促炎反应。本研究旨在确定这种活性是否来源于其主要的多糖成分——阿拉伯半乳聚糖，并探讨多糖结构（核心链与侧链）如何影响这种活性。我们使用Smith降解法从阿拉伯胶中纯化了阿拉伯半乳聚糖。该过程去除了大部分侧链，并显著降低了蛋白质含量（从131.85 μg/mL降至1.36 μg/mL）。关键发现表明，经过Smith降解后的阿拉伯半乳聚糖具有与未纯化的阿拉伯胶明显不同的免疫调节特性。纯化的阿拉伯半乳聚糖与IFN-γ结合时既不诱导一氧化氮的产生，也不显著影响活性氧的生成。然而，一个新的观察结果是它在RAW 264.7细胞中诱导了粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的产生（增加了2.3倍），进而导致肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的水平升高，同时显著降低了IL-10的水平。与阿拉伯胶不同，后者能诱导IL-17的产生增加超过10倍，而纯化的阿拉伯半乳聚糖的核心链未能刺激IL-17的产生。这种抑制作用与下游TNF-α和IL-6水平的降低以及IL-1β的完全缺失相关。纯化的阿拉伯半乳聚糖促进了更平衡的M1/M2表型，而不是阿拉伯胶所呈现的强烈M1极化。研究表明，阿拉伯胶的高促炎活性（包括一氧化氮和IL-17的诱导）可能归因于蛋白质杂质或完整的侧链结构，而非阿拉伯半乳聚糖核心本身。因此，阿拉伯半乳聚糖的纯度对其免疫调节功能至关重要。

**1. 引言**
巨噬细胞在各种生物过程中起着关键作用，可被不同刺激激活并呈现不同的表型。两种主要的研究激活状态是M1（经典激活）和M2（交替激活）状态（Hao等人，2012年）。M1状态以促炎反应为特征。M1巨噬细胞分泌细胞因子，产生活性氧（ROS），并生成一氧化氮（NO）以消灭微生物。它们还增强主要组织相容性复合体（MHC）分子I/II以及共刺激分子CD80和CD86的表达（Murray等人，2014年）。相比之下，M2巨噬细胞具有抗炎功能，可抑制Th1/M1驱动的炎症并促进组织修复。此外，M2巨噬细胞还能提高胰岛素敏感性，并介导Th2驱动的病理过程，如哮喘和寄生虫感染（Gordon & Martinez，2010年；Van den Bossche等人，2009年）。
植物多糖可通过作用于巨噬细胞来调节先天免疫系统，这种效应取决于多糖的结构特性。阿拉伯胶是从金合欢树中提取的天然分泌物，是一种含有多糖和糖蛋白的复杂混合物。阿拉伯胶中的多糖成分主要由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸组成。其分子结构高度分支，主链由(1,3)-连接的β-D-半乳吡喃糖单元构成，侧链通过(1,6)键连接到主链上。阿拉伯胶主要包括三个主要组分：（1）含量丰富的低蛋白阿拉伯半乳聚糖（AG）；（2）高分子量的富含蛋白质的阿拉伯半乳聚糖-蛋白质复合物（AGP）；（3）含量较少的高蛋白糖蛋白（GP）（Idris等人，1998年；Mahendran等人，2008年）。
阿拉伯胶的乳化特性使其在食品工业中得到广泛应用（Al-Assaf等人，2007年；Dickinson等人，1988年；Randall等人，1988年）。此外，阿拉伯胶还显示出治疗潜力，包括预防药物引起的肾脏损伤（Al-Majed等人，2002年，2003年）和活性化合物的微囊化（Edris等人，2016年；Laureanti等人，2023年）。在免疫调节方面，阿拉伯胶中的主要多糖——阿拉伯半乳聚糖具有免疫刺激活性（Ferreira等人，2015年；Lin等人，2022年；Schepetkin & Quinn，2006年）。然而，先前的研究表明，单独使用阿拉伯胶的促炎效果有限。阿拉伯胶的显著活性源于其与干扰素-γ的协同作用。两者结合后能有效激活巨噬细胞，并使其向促炎的M1表型极化。这种组合使一氧化氮的产生增加了320%以上，促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和白细胞介素-6（IL-6）的释放增加了100多倍（Lin等人，2022年）。尽管已知阿拉伯胶的协同效应，但其多糖结构中的哪一部分（主链或侧链）对这种免疫活性至关重要仍不清楚。本研究利用Smith降解技术来探讨这一问题。Smith降解通过氧化-还原过程选择性地降解复杂多糖。第一步去除大部分外侧链及其末端糖基残基，后续步骤进一步去除剩余的阿拉伯糖和外部(1→6)-连接的半乳糖侧链，最终仅留下(1→3)-连接的半乳糖主链（Anderson & Yin，1988年）。因此，本研究将使用Smith降解处理阿拉伯胶，并比较降解产物（即半乳糖主链）与天然阿拉伯胶在调节RAW 264.7巨噬细胞M1极化表型方面的能力。

**2. 材料与方法**
2.1. 细胞系
RAW 264.7小鼠巨噬细胞系购自台湾新竹的生物资源收集与研究中心（BCRC）。
2.2. 材料
过氧化钠购自Thermo Fisher Scientific旗下的Alfa Aesar（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。噻唑蓝四唑溴化物（MTT）购自Bio Basic（加拿大安大略省马克汉姆）。用于测量TNF-α水平的Mouse TNF-α DuoSet ELISA试剂盒购自R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）。Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay试剂盒购自Bio-Rad（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Hyclone（Cytiva，Danaher集团，英国白金汉郡）。阿拉伯胶（G9752）及其他所有化学品均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。
2.3. 阿拉伯半乳聚糖的制备
使用Smith降解法从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖。首先在4°C下，将20克阿拉伯胶在2.0升0.1 M过氧化钠溶液中氧化7天。然后终止反应，用乙二醇中和，浓缩后用水透析。接着在室温下用硼氢化钠还原约16小时。再次中和并透析后，用1 N三氟乙酸水解样品过夜。水解后离心去除不溶性物质，再用乙醇沉淀半乳聚糖。所得沉淀物依次用70%乙醇、无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤，最后冻干。为了获得纯化的阿拉伯半乳聚糖，至少需要重复三次此过程（Goldstein等人，1956年；Tsumuraya & Hashimoto，1987年）。
2.4. FTIR光谱分析
将阿拉伯半乳聚糖与溴化钾混合后制成颗粒进行测量。使用溴化钾颗粒作为空白对照进行仪器标准化，光谱记录范围为650–4000 cm-1。使用Thermo Nicolet型号6700的FT-IR光谱仪（英国）。
2.5. 细胞培养和细胞毒性测定
RAW 264.7细胞在添加了10% FBS的DMEM培养基中于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。每3天传代一次以维持细胞系。使用MTT测定法评估RAW 264.7细胞的存活率。将RAW 264.7细胞以1 × 10^5个细胞/孔的密度接种在96孔板中培养24小时（Lim等人，2024年）。随后，细胞分别用40 ng/mL IFN-γ和50 mM醋酸钠缓冲液（作为对照）或0.1%、0.3%、0.4%、0.5%的阿拉伯半乳聚糖溶液处理24小时。去除上清液后，向每个孔中加入0.5 mg/mL的MTT试剂并培养1小时。96孔板中的甲酚蓝结晶用DMSO溶解，然后用酶联免疫吸附测定（ELISA）读数仪测量570 nm处的吸光度。
2.6. 一氧化氮、TNF-α和细胞因子的产生测定
RAW 264.7细胞在24孔板中培养24小时（每孔2 × 10^5个细胞），然后加入阿拉伯半乳聚糖和IFN-γ，继续培养24小时。最后通过测量亚硝酸盐水平评估一氧化氮的产生，使用ELISA试剂盒评估TNF-α的产生。培养基中其他促炎细胞因子的浓度使用Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay Kit测定（Yamamoto等人，2007年）。
2.7. 活性氧测定
将RAW 264.7细胞以1 × 10^5个细胞/孔的密度接种在24孔板中培养24小时。接着用0.3%阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL IFN-γ处理24小时。培养后加入OxiVision Green?过氧化氢传感器（AAT Bioquest，美国加州桑尼维尔），并在37°C下进一步培养15分钟。使用ELISA读数仪在485 nm激发波长和528 nm发射波长下测量荧光强度。
2.8. 统计分析
所有实验至少重复三次。数据以平均值±标准误差（SE）表示。使用Student’s t检验将平均值与相应对照组进行比较。P值<0.05表示具有统计学意义。

**3. 结果**
3.1. 从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖
通过多步骤降解和分离过程系统地研究了从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖的方法。从100.00克阿拉伯胶粉末开始，依次进行Smith降解步骤以富集所需的多糖组分。第一次Smith降解后，所得物质的产量为43.68 ± 0.78克。第二次Smith降解进一步提纯，产量为8.23 ± 0.42克。最终纯化步骤得到1.65 ± 0.22克的β-1,3-半乳聚糖。该纯化方案展示了从复杂天然来源中获取特定多糖组分的方法（表1）。
**表1. 从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖的过程**
| 步骤 | 收率 |
|-----------------|-----------|
| 第一次Smith降解 | 43.68 ± 0.78 |
| 第二次Smith降解 | 8.23 ± 0.42 |
| 最终纯化 | 1.65 ± 0.22 |

为了进一步表征从阿拉伯胶中纯化的阿拉伯半乳聚糖，分析了其相对半乳糖和蛋白质含量。如表2所示，纯化后相对半乳糖含量显著增加。从100 μg/mL的阿拉伯胶开始，相对半乳糖含量为67.50 ± 10.01 μg/mL。纯化为阿拉伯半乳聚糖后，相对半乳糖含量显著升高至79.73 ± 7.08 μg/mL（表2）。
**表2. 从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖的相对半乳糖含量**
| 步骤 | 相对半乳糖含量（μg/mL）|
|-----------------|-------------|
| 原始阿拉伯胶 | 67.50 ± 10.01 |
| 纯化后的阿拉伯半乳聚糖 | 79.73 ± 7.08 |

此外，如表3所示，蛋白质含量显著降低。初始100 mg/mL的阿拉伯胶含有131.85 ± 1.56 μg/mL的蛋白质，纯化后的阿拉伯半乳聚糖蛋白质含量降至1.36 ± 0.34 μg/mL。这种蛋白质含量的显著降低表明纯化过程有效去除了蛋白质杂质。
**表3. 从阿拉伯胶中纯化阿拉伯半乳聚糖的蛋白质含量**
| 步骤 | 蛋白质含量（μg/mL）|
|-----------------|-------------|
| 原始阿拉伯胶 | 131.85 ± 1.56 |
| 纯化后的阿拉伯半乳聚糖 | 1.36 ± 0.34 |

3.2. FTIR光谱分析
通过FT-IR光谱中特征峰的变化（移动、消失和减弱）可以有效地确定原始阿拉伯胶及其经Smith降解后的差异（图1）。
**图1. 阿拉伯胶和经Smith降解后的阿拉伯半乳聚糖的FT-IR光谱对比**
先前的研究表明，3000–3600 cm-1和2800–3000 cm-1范围内的光谱带分别对应OH和CH伸缩模式（Bashir & Haripriya，2016年）。3414 cm-1处的峰仅由OH基团引起。阿拉伯胶中的2920 cm-1峰归因于CH伸缩振动。1735 cm-1处的峰归因于醛基的C = O伸缩振动。1599 cm-1和1639 cm-1处的吸收峰分别对应酰胺II带和酰胺I带，由NH弯曲、CN伸缩和肽键的C = O伸缩振动引起（Abba等人，2021年）。1599 cm-1处的透射率从93%变为97%，1639 cm-1处的透射率从95%变为96%。FT-IR曲线中的1027 cm-1和844 cm-1峰可能属于阿拉伯半乳聚糖。在779.2 cm-1处的峰值（阿拉伯胶）可能对应于半乳糖的1–4键连接和甘露糖的1–6键连接（Mudgil等人，2012年）。3.3 RAW 264.7细胞的增殖和一氧化氮的产生RAW 264.7小鼠巨噬细胞用阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ处理24小时，以评估其对细胞增殖的影响。当与0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ一起孵育时，未观察到RAW 264.7小鼠巨噬细胞增殖的显著变化。当使用0.4%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ进行实验时，细胞活力显著降低至77%（图2a）。因此，所有后续实验中阿拉伯半乳聚糖的浓度设定为0.3%与40 ng/mL的IFN-γ。如图2b所示，在用0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ诱导后，RAW 264.7细胞没有产生一氧化氮。下载：下载高分辨率图像（213KB）下载：下载全尺寸图像图2. RAW 264.7细胞的增殖和一氧化氮的产生。a. 阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ对RAW 264.7细胞活力的影响与未处理细胞（对照组）相比。b. 阿拉伯半乳聚糖对RAW 264.7细胞中亚硝酸盐释放的影响与LPS和IFN-γ刺激的细胞（对照组）相比。数据表示为至少三次独立实验的平均值±标准误差。*，p < 0.05，**，p < 0.01，***，p < 0.001。3.4 细胞因子分泌的时间过程使用TNF-α来评估细胞因子释放与RAW 264.7细胞被0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ诱导的时间之间的关系。图3显示随着诱导时间的增加，TNF-α水平稳步上升。在诱导6小时后，TNF-α的释放达到峰值（11,845 pg/mL）。6小时后，TNF-α水平开始下降。下载：下载高分辨率图像（97KB）下载：下载全尺寸图像图3. RAW 264.7细胞在0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合诱导下的TNF-α分泌。数据表示为至少三次独立实验的平均值±标准误差。*，p < 0.05，**，p < 0.01，***，p < 0.001，与未处理细胞（对照组）相比。对照组；0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL。对照组。3.5 各种细胞因子积累的时间依赖性在用0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合处理后，研究了RAW 264.7巨噬细胞在两个不同时间点的炎症细胞因子分泌谱。细胞因子浓度表示为相对于未处理对照组的倍数变化。如图4（6小时孵育）所示，早期反应的特点是特定细胞因子的强烈诱导。TNF-α的增加最为显著，增加了52倍。RANTES也显著增加，增加了14倍，而G-CSF增加了8倍。其他细胞因子，包括IL-13、IL-9、IL-6、IFN-γ、IL-1α、IL-10、GM-CSF、IL-12（p70）和MCP-1，也有所增加，通常的倍数变化范围在1.5到4倍之间。下载：下载高分辨率图像（117KB）下载：下载全尺寸图像图4. RAW 264.7细胞在0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合诱导下6小时后的炎症细胞因子分泌。将孵育时间延长至24小时（图5）显示免疫信号蛋白的变化。TNF-α仍然最高，但其增加幅度降至16倍，表明它可能更早达到峰值或被反馈机制降低。G-CSF从6小时的8倍增加到24小时的9倍。RANTES从14倍降至约1.5倍。IL-9在6小时时增加了大约4倍，但在24小时时降至0.9倍，表明其水平低于对照组。下载：下载高分辨率图像（121KB）下载：下载全尺寸图像图5. RAW 264.7细胞在0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合诱导下24小时后的炎症细胞因子分泌。IL-17A在24小时时增加了3倍，表明其诱导是延迟的或持续的。其他细胞因子，如IL-1α、Eotaxin、IL-10、IL-12（p70）、IL-4、IL-1β、IL-6、IFN-γ、MCP-1和IL-9，在24小时时的诱导水平基本保持不变或略有变化，大多数在1到2倍的范围内。这些时间过程实验表明，0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合在RAW 264.7细胞中引发了动态的炎症反应，最初表现为TNF-α和RANTES的强烈释放，随后在后期时间点表现为更持久的、可能多样化的细胞因子谱。3.6 ROS积累的时间依赖性在这项研究中，使用OxiVision Green?过氧化氢传感器试剂盒检测了RAW 264.7细胞在用0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ刺激1小时、3小时、6小时、12小时、18小时和24小时后的ROS释放。如图6所示，0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ组合略微诱导了RAW 264.7细胞的ROS释放。下载：下载高分辨率图像（147KB）下载：下载全尺寸图像图6. 0.3%的阿拉伯半乳聚糖和40 ng/mL的IFN-γ诱导的RAW 264.7巨噬细胞中的ROS产生。4. 讨论M1巨噬细胞是“经典激活”的促炎细胞，释放许多促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α，并产生NO和蛋白水解酶（Fernandes等人，2020年）。相比之下，M2巨噬细胞是“交替激活”的抗炎细胞，由IL-13和IL-4诱导。它们具有调节和抑制功能，产生抗炎因子如IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）以缓解炎症（Mantovani等人，2002年）。RAW 264.7巨噬细胞因其对TLR配体的敏感反应而被广泛用作免疫调节多糖的初步筛选的强大和标准模型。我们的实验室之前已经使用该模型建立了统一的研究框架来研究阿拉伯胶（Lin等人，2022年），这为当前研究中比较粗提阿拉伯半乳聚糖与纯化阿拉伯半乳聚糖的效果提供了可靠的基准。虽然RAW 264.7细胞在分泌成熟IL-1β蛋白方面的效率低于BMDMs或THP-1细胞（Gan等人，2025年），但多项研究表明，在强烈刺激下，它们仍能在mRNA水平或通过非经典途径表达IL-1β。在我们的研究中，我们旨在展示整体的免疫调节效应，而不仅仅是关注NLRP3-ASC-caspase-1轴。根据先前的研究，3%的阿拉伯胶和40 ng/mL的IFN-γ的组合导致TNF-α、G-CSF和IL-6的水平比其他条件高出100倍以上。IL-3、RANTES、IL-17A、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-13、KC、IL-5、IL-4、IL-12、Eotaxin、IL-9和MCP-1的释放也增加了（Lin等人，2022年）。然而，在这项研究中，我们的结果表明纯化阿拉伯半乳聚糖组分具有不同的免疫学特征。当0.3%的阿拉伯半乳聚糖与40 ng/mL的IFN-γ一起刺激RAW 264.7细胞时，这种纯化成分并未触发NO的产生。此外，尽管TNF-α的产生增加了，但仅比未处理细胞高52倍；RANTES增加了14倍，G-CSF增加了8倍。其他细胞因子，包括IL-13、IL-9、IL-6、IFN-γ、IL-1α、IL-10、GM-CSF、IL-12（p70）和MCP-1，也有所增加，通常的倍数变化范围在1.5到4倍之间。ROS的产生与未处理对照组没有显著差异。先前的研究表明，阿拉伯胶和IFN-γ的组合可以诱导G-CSF的产生。这项研究也使G-CSF增加了8倍。G-CSF不仅是一种造血因子，可刺激骨髓中的产生和释放中性粒细胞，还具有进一步的调节功能[16]。在巨噬细胞中，G-CSF通过激活STAT-3通路抑制TNF-α产生的关键介质，最终抑制c-Jun-N末端激酶（JNK）的激活（Kim等人，2006年）。与先前的研究不同，这些研究表明将阿拉伯胶与IFN-γ结合并不产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），而本研究发现将IFN-γ与从阿拉伯胶中纯化的阿拉伯半乳聚糖结合，在与IFN-γ共同处理6小时后，G-CSF水平增加了2.3倍。这一发现的重要性在于G-CSF的作用，它被认为具有高度特异性。研究表明，它显著增加了促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的产生，同时可能减少了具有抗炎或免疫调节功能的细胞因子（如IL-10和IL-12）的产生。G-CSF选择性地影响巨噬细胞向炎症表型的转变（Bergamini等人，2000年）。G-CSF的存在也可能解释了与先前研究相比观察到的IL-10产生较低的原因。与先前的研究相比，IL-13的分泌相似，约为4倍。IL-13与IL-4、IL-3、IL-5和IL-9属于Th2辅助细胞家族（Frazer等人，1997年）。尽管其对TNF的抑制作用在不同研究中略有差异，但大多数研究表明，IL-13显著抑制或下调了由炎症引起的TNF，尤其是在类风湿性关节炎（RA）患者的滑膜细胞中。除了激活M2巨噬细胞外，IL-13还可以抑制其他促炎细胞因子如IL-1、IL-6和IL-8的分泌。作为Th2介导的免疫的关键组成部分，它在哮喘和特应性皮炎等过敏性炎症疾病的发展中起着重要作用。它通过STAT6信号通路影响多种细胞，包括B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和成纤维细胞（Iwaszko等人，2021年）。与先前的研究结果形成鲜明对比的是，阿拉伯胶诱导了IL-17超过10倍的增加，而本研究中使用的纯化阿拉伯半乳聚糖在刺激RAW 264.7细胞时未能刺激IL-17的产生。作为一种强效的促炎细胞因子，IL-17A可以通过激活多种关键信号通路直接驱动巨噬细胞分化为促炎表型，包括p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB和AP-1。这种激活最终导致高水平的促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的分泌。这项研究中IL-17反应的减弱与下游TNF-α和IL-6的显著减少以及IL-1β的完全缺失相关。此外，IL-17A不仅促进炎症，还增强了巨噬细胞的先天防御机制，提高了它们清除细胞内病原体（如分枝杆菌）的能力，这对免疫保护至关重要。重要的是，这两种机制是相互关联的。IL-17A激活引发的细胞内反应进一步刺激了IL-1α和IL-1β的释放，从而鼓励Th17细胞产生更多的IL-17A。通过直接激活促炎通路和间接支持抗菌功能，IL-17A在对抗感染和调节炎症疾病中起着关键作用（Chen等人，2013年；Orosz等人，2016年）。对天然阿拉伯胶及其纯化阿拉伯半乳聚糖的综述表明，细胞因子积累的整体减少与阿拉伯半乳聚糖的分类有关，更重要的是，与本研究中使用的纯化方法密切相关。阿拉伯半乳聚糖（AGs）分为两大结构组：I型AGs是阿拉伯-4-半乳聚糖（1,4-β-d-半乳聚糖，装饰有α-l-阿拉伯糖，α-l-Ara），II型AGs是阿拉伯-3,6-半乳聚糖（1,3:1,6-β-d-半乳聚糖骨架，装饰有α-l-Ara）（Nie等人，2013年）。来自阿拉伯胶的阿拉伯半乳聚糖被归类为II型AGs，其特征是β-d-半乳聚糖骨架，侧链含有鼠李糖和高含量的尿酸（Ali等人，2009年；Ghosh等人，2023年）。Smith降解是一种通过特定化学步骤分解分子来分析II型AGs详细结构的有价值方法。该过程切割1,6键连接，同时保持1,3键连接，从而产生短的1,3-β-半乳聚糖（Clarke等人，1979年；Sato等人，2018年）。表4总结了具有显著生物功能的来自高等植物的阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖可以调节巨噬细胞功能，从而影响免疫反应。表4。**高等植物中阿拉伯半乳聚糖的总结：这些阿拉伯半乳聚糖对巨噬细胞具有显著的生理效应**

| 植物 | 细胞类型 | 免疫效应 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- |
| 阿卡西亚塞内加尔（Acacia senegal） | 小鼠RAW 264.7细胞 | TNF-α、RANTES、G-CSF、IL-13、IL-9、IL-6、IFN-γ、IL-1α、IL-10、GM-CSF、IL-12、MCP-1 | 本研究 |
| 阿卡西亚塞内加尔（Acacia senegal） | 小鼠RAW 264.7细胞 | TNF-α、G-CSF、IL-6、IL-3、RANTES、IL-17A、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-13、KC、IL-5、IL-4、IL-12、Eotaxin、IL-9、MCP-1 | Lin等人，2022年 |
| 矮草（Alopecurus pratensis） | 小鼠树突状细胞 | IL-10 | Peters等人，2010年 |
| 蒙大拿金盏花（Arnica Montana） | 小鼠腹膜巨噬细胞 | TNF-α | Puhlmann等人，1991年 |
| 芝麻胶（Ferula gummosa） | 小鼠RAW 264.7细胞 | NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 | Tabarsa等人，2020年 |
| 茉莉（Jasminum sambac (L.) Aiton）茶加工废弃物 | 小鼠RAW 264.7细胞 | NO、TNF-α、IL-6 | Huang等人，2023年 |
| 石南（Juniperus scopulorum） | 小鼠J774.A1细胞 | IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10 | Schepetkin等人，2005年 |
| 西伯利亚落叶松（Larix kaempferi） | 小鼠RAW 264.7细胞 | NO、TNF-α、IL-6、IL-1β | Huang等人，2024年 |
| 西部落叶松（Larix occidentalis） | 人类外周血单核细胞和非粘附细胞 | IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6 | Hauer & Anderer，1993年 |
| 柠檬苦瓜（Morinda citrifolia） | 小鼠腹膜巨噬细胞 | TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12 p70、IFN-γ、NO | Hirazumi & Furusawa，1999年 |
| 棕榈菜叶（Moringa oleifera） | 小鼠RAW 264.7细胞 | NO、TNF-α、IL-6 | Gu等人，2024年 |
| 人参（Panax notoginseng） | 小鼠脾淋巴细胞和腹膜巨噬细胞 | TNF-α | Gao等人，1996年 |
| 五叶人参（Panax quinquefolius） | 大鼠肺泡巨噬细胞 | TNF-α | Assinewe等人，2002年 |
| 芦苇花粉（Pollen Typhae） | 小鼠RAW 264.7细胞 | NO、TNF-α、IL-6 | Xu等人，2023年 |

**研究结果表明：**
弱酸水解会降低阿拉伯半乳聚糖的免疫刺激活性（Wang等人，2005年）。研究还表明，随着阿拉伯半乳聚糖侧链（尤其是阿拉伯糖）的逐渐去除，其免疫调节活性也会下降。这表明，如果阿拉伯胶的侧链结构被破坏（例如通过Smith降解），其免疫反应性可能会减弱，说明侧链的完整性对其生物功能至关重要（Xu等人，2023年）。

在我们的研究中，从阿拉伯胶中纯化的阿拉伯半乳聚糖与原始阿拉伯胶在结构上存在明显差异，这一点通过FTIR光谱得到证实。对总糖和蛋白质含量的进一步分析验证了纯化过程的有效性，结果显示纯化后的阿拉伯半乳聚糖中的蛋白质含量显著降低。

经典的连续Smith降解研究表明（针对塞内加尔阿拉伯胶和塞亚尔阿拉伯胶），连续Smith处理不仅去除了蛋白质，还显著改变了其碳水化合物组成，几乎完全去除了阿拉伯糖、鼠李糖和尿苷酸，最终得到富含半乳聚糖的核心（Anderson & McDougall，1987年）。进一步的结构分析显示，反复的Smith降解选择性地切割了含有邻二醇的残基，去除了富含阿拉伯糖和尿苷酸的侧链，并富集了1,3-连接的半乳聚糖骨架（Anderson & Yin，1988年）。这些研究表明，Smith降解更适合作为将高度分支的II型阿拉伯半乳聚糖-蛋白质复合物转化为结构简化的、去支化的半乳聚糖核心的工具，而不仅仅是一个简单的降低蛋白质含量的纯化步骤。与这一概念一致，我们的FTIR数据和糖/蛋白质比例测定结果支持这样的结论：经过三次Smith降解后得到的组分是从阿拉伯胶中提取的、去支化的、富含半乳聚糖的阿拉伯半乳聚糖，其蛋白质结合能力和侧链结构发生了显著变化。

实际上，由于多糖的异质性和复杂性，对其完整结构的阐明具有挑战性。根据多糖研究的常规做法，我们的研究重点是从阿拉伯胶中部分纯化阿拉伯半乳聚糖，并研究其在RAW 264.7巨噬细胞中的免疫调节效应。尽管其完整结构尚未确定，但这些数据足以重现我们的提取和表征程序，并支持所呈现的生物活性结果。为了评估多糖的整体结构，需要进行核磁共振（NMR）、单糖组成分析以及尺寸排阻色谱（SEC）分子量分布分析等后续实验，这些实验正在计划和设计中。

我们纯化的阿拉伯半乳聚糖的促炎活性降低可能与其成分不同有关。这一观点得到了从狭叶香蒲（Typha angustifolia）中分离出两种对RAW 264.7细胞具有相反作用的多糖的研究的支持。具体来说，来自该来源的低蛋白异多糖组分有效抑制了TNF-α、IL-6和ROS的产生，强调了成分在调节免疫反应中的重要性（Wei等人，2021年）。

**结论：**
本研究表明，通过Smith降解从阿拉伯胶中纯化的阿拉伯半乳聚糖（AG）表现出与原始阿拉伯胶不同的免疫调节特性，尽管两者都倾向于M1极化。具体而言，阿拉伯半乳聚糖的促炎潜力较低，且不会诱导NO/ROS的产生。重要的是，我们发现它能够诱导GM-CSF的产生——这一新发现可能解释了观察到的低IL-10水平。我们的结果揭示了纯化阿拉伯半乳聚糖的独特免疫调节机制，即通过诱导GM-CSF来发挥作用。这一途径通过上调TNF-α和IL-6促进促炎环境，同时减弱调节反应，表现为IL-10的显著抑制和IL-12的下调。IL-17的缺失与TNF-α和IL-6的显著降低直接相关，且IL-1β完全缺失，表明这些细胞因子位于IL-17途径的下游。然而，AG仍能诱导与M2相关的IL-13。这表明我们纯化的AG促进了更平衡的M1/M2混合表型，不同于原始阿拉伯胶的强烈M1极化。我们得出结论，阿拉伯胶的高促炎活性可能是由于杂质（如蛋白质）的影响，而非阿拉伯半乳聚糖本身。这强调了阿拉伯胶的纯度对其免疫调节功能至关重要，对其作为精确免疫调节剂的发展也非常关键。

**伦理声明 - 人类和动物研究**
本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

**作者贡献声明：**
Chui Li Lim：撰写——初稿、研究、数据管理
Wei-Lin Chen：撰写——审阅与编辑、监督、研究
Chia-Yu Lin：研究
Chao-Hsun Yang：撰写——审阅与编辑、监督