综述：抗产肠毒素大肠杆菌多价基因工程疫苗的研究进展

《Frontiers in Immunology》：Research progress on multivalent genetically engineered vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli

　　

本综述系统阐述了产肠毒素大肠杆菌（ETEC）引起腹泻的病原学特征、流行病学及其防控现状。ETEC是引起幼龄动物腹泻的重要致病菌，其致病性与特定的粘附素和肠毒素密切相关。文章重点分析了ETEC血清型的多样性及其与致病性的关系，探讨了不同动物宿主和年龄组的易感性差异，并概述了其通过污染的水和食物传播的流行病学特征。针对抗生素滥用导致的耐药性问题，文章指出疫苗接种是当前最有效的防控策略。文章总结了针对菌毛抗原和肠毒素的多价疫苗、基因工程疫苗及新型活载体疫苗的研究进展与应用潜力。本综述旨在为更深入地理解ETEC的致病机制，以及开发高效、广谱的疫苗提供重要的理论见解。

ETEC致病性与血清型的关系

ETEC是引起包括仔猪、犊牛、羔羊和断奶仔猪在内的许多动物腹泻的重要病原体，感染动物常因严重水样腹泻和快速脱水而死亡，发病率和死亡率高。其致病性与特定的粘附因子和肠毒素密切相关，感染与病原体特征、环境条件和宿主易感性有关。存在约40种典型的ETEC血清型，主要O抗原群有O8、O9、O20、O45、O60、O64、O101、O115、O139、O141、O148和O157等。在不同地区和时期，可分离到的优势菌株存在差异。

ETEC毒力因子

ETEC具有相对复杂的抗原组成，主要包括O抗原、K抗原、H抗原和菌毛抗原。O抗原是一种耐热的细菌抗原，在^{E. coli血清型分类中起关键作用。K抗原是位于细菌表面的多糖或蛋白抗原，主要存在于菌毛、荚膜或包膜中。H抗原是鞭毛蛋白抗原，具有良好的抗原性。}

ETEC产生粘附素、肠毒素、内毒素和溶血素等毒力因子，其中肠毒素和粘附素在感染的发生和免疫学中起重要作用。主要的粘附素抗原有K88(F4)、K99(F5)、987p(F6)、F41、F42等，其中K88是最常见的粘附素抗原，主要包括K88ac、K88ab、K88ad和K88ae。近年来，F18菌毛已成为另一个重要的粘附素，尤其与仔猪断奶后腹泻（PWD）相关。自2017年前后，F18的检出率稳步上升，而K88（F4）在某些地区的流行率有所下降。所有已知的ETEC粘附素均为耐热蛋白，在100°C加热可破坏其生物和免疫学活性。这些粘附素具有良好的抗原性，可刺激机体产生高效抗体。

肠毒素

肠毒素根据其作用机制和热稳定性可分为耐热肠毒素（ST）和不耐热肠毒素（LT），这两种肠毒素可单独或同时产生，其产生由质粒控制。ST根据抗原性和宿主差异分为ST₁和ST₂，ST₁又包括ST_1a和ST_1b。ST₁是由18或19个氨基酸组成的小肽，在100°C加热30分钟仍保持活性但无免疫原性。LT由一个28 kDa的A亚基和五个11.5 kDa的B亚基组成，完整的LT分子和B亚基均具有良好的免疫原性。ST₁的毒性与分子内的三个二硫键密切相关，其本身无免疫原性，但与大分子结合后可显现免疫原性。研究表明，引起仔猪大肠杆菌病的产肠毒素^{E. coli菌株中，20-30%为LT+/ST-，30-40%为LT+/ST+，而LT-/ST+菌株约占50%。与LT相比，ST在产肠毒素E. coli引起的幼畜腹泻病中起着更重要的作用。}

ETEC毒力因子的致病机制

ETEC的致病性从根本上由其粘附素与宿主肠道受体的特异性相互作用决定。在猪中，ETEC菌株利用包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)、F41和F18在内的一系列粘附素进行定植，其中F18菌毛是断奶后腹泻（PWD）的主要病原体。相应宿主受体的表达受发育调控：K88（F4）的受体从出生就存在，而F18受体的完全表达通常发生在20日龄左右。对于反刍动物，流行的ETEC粘附素包括K99、F41和F17a。粘附素的结合特异性决定了其宿主范围。粘附素为蛋白抗原，免疫原性强，基于粘附素的疫苗开发具有理论基础。

肠毒素是导致腹泻的直接致病因子。已证实ST₁可激活小肠上皮细胞中的鸟苷酸环化酶（GC），导致细胞内cGMP浓度升高，进而激活蛋白激酶G II（PKGII）和蛋白激酶A（PKA），从而破坏电解质分泌并导致腹泻。LT或其B亚基具有良好的免疫原性。A亚基是毒素的活性成分。B亚基与肠粘膜细胞上的GM1神经节苷脂结合，促进孔道形成。释放的A亚基通过孔道进入细胞，激活腺苷酸环化酶，从而提高宿主细胞中cAMP的浓度，并激活cAMP依赖性蛋白激酶，引发肠粘膜细胞将过量的水和电解质分泌到肠腔，导致腹泻。其作用机制如图所示。

使用ETEC多价疫苗进行免疫预防

免疫预防是比药物治疗更有前景和可持续的ETEC致幼畜腹泻防控策略。早期的基因工程疫苗研究为多价疫苗的发展奠定了基础。早期研究利用基因工程技术成功构建了针对特定粘附素或肠毒素的各种二价疫苗，例如K88-K99双抗原工程菌苗、K88ac-LT_B和K99-F41等。针对肠毒素，早期研究涉及将ST与LT的B亚基进行基因融合或化学偶联。这些开创性研究证实了通过基因工程组合多个关键毒力因子抗原的可行性，但这些早期疫苗通常保护谱较窄，且ST的有效脱毒和呈递问题仍未完全解决。

大肠杆菌K88/K99二价基因工程疫苗

研究人员用限制性内切酶^BamHI切割含有^K88和^K99基因的质粒pTK90和pTK56，然后用T₄DNA连接酶连接，将其转化到大肠杆菌C600菌株中，筛选出携带质粒pTK8899的基因工程菌株。将该疫苗在分娩前约21天给妊娠母猪接种，结果表明初乳中存在高滴度的K88和K99抗体，仔猪通过吸吮初乳可有效抵抗ETEC感染。该冻干制剂可长期保存，有利于储存和运输。

K88ac-LT_B二价基因工程疫苗

用限制性内切酶^BamHI分别消化含有^K88ac基因的质粒pMM031和含有^LT_B基因的质粒pPMC4，构建重组质粒pMM085，将其转化到C600菌株中创建重组菌株MM-3。研究表明MM-3可作为活疫苗预防仔猪腹泻。为解决常用抗性基因可能带来的生物危害问题，研究人员将^LacZ基因插入到含有LT_B亚基基因的质粒载体中，构建了可同时表达LT_B亚基和β-半乳糖苷酶并含有四环素抗性基因的重组质粒，随后将^K88ac基因插入重组质粒的四环素抗性基因中，从而使四环素抗性基因失活。测试表明重组质粒MM-6可表达LT_B和K88ac抗原，且^LacZ基因作为良好的筛选标记取代了四环素抗性基因。利用细菌质粒转化技术，将含有^LT_B和^K88ac抗原基因的重组质粒转化到减毒猪霍乱沙门氏菌株中，转化菌保留了沙门氏菌的形态、生化和抗原特性，同时能稳定高效表达LT_B和K88ac抗原。

K99-F41二价基因工程疫苗

用^BamHI酶消化含有^K99基因的质粒pMGK99，并将其与^F41基因连接，构建重组质粒pMG611，将转基因菌株MM-7转化到大肠杆菌HB101中。ELISA检测显示MM-7中K99和F41菌毛抗原的表达水平高于野生型菌株。用MM-7对妊娠母羊进行皮下免疫可诱导主动免疫，羔羊通过摄入母羊的初乳获得被动免疫。免疫测定结果表明MM-7具有良好的免疫原性。

ST₁-LT_B二价基因工程疫苗

ST与LT的融合研究首先在蛋白质水平进行。研究表明，将ST与LT以化学方式偶联，可显著降低其毒性，并赋予其免疫原性。将合成的STa与载体蛋白偶联，并使用弗氏佐剂免疫动物，可引发抗体反应。使用LT作为ST的载体蛋白可使ST成为完全抗原，能够诱导针对ST和LT的免疫应答。在基因融合研究中，ST和LT_B之间的连接处会影响融合蛋白各部分的免疫活性，合适的接头对于维持融合蛋白各部分良好的活性非常重要。此外，融合蛋白的分泌表达对于构建ETEC疫苗候选株也至关重要。研究人员通过重复串联融合将^ST基因与编码β-半乳糖苷酶的^LacZ基因融合，发现串联^ST基因的表达产物抗原性增强且无毒性，这为今后的LT_B和ST基因融合研究提供了有效途径。

目前市场上使用的主要疫苗包括K88-K99、K88ac-LT_B和K88-K99-LT_B基因工程疫苗。由于仔猪大肠杆菌病的直接致病因子ST的毒性问题尚未解决，免疫效果并不理想。本团队构建了^{Pro-ST₁-LacZ}融合基因，研究表明其表达的融合蛋白失去了ST₁的毒性，免疫小鼠产生的抗体能够中和天然ST₁的毒性。同时，我们成功构建了Pro-ST₁-LT_B融合基因，动物实验证明，使用灭活菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)的全培养物作为二价基因工程疫苗，可有效预防新生仔猪由产肠毒素大肠杆菌肠毒素引起的大肠杆菌病。

随后，我们利用聚合酶链式反应和基因定点突变技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出^K88ac基因、^ST₁突变基因和^LT_B基因，利用DNA重组技术构建了含有^{K88ac-ST₁-LT_B}融合基因的重组表达质粒pXKST3LT5，并将其转化到受体菌BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT3)。酶切鉴定和DNA序列分析证实重组表达质粒pXKST3LT5含有^{K88ac-ST₁-LT_B}融合基因，基因序列和阅读框均正确。SDS-PAGE和ELISA结果表明重组菌株可表达K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白。动物实验证明，工程菌表达的K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白无毒，免疫原性测试证实该融合蛋白具有良好的免疫原性，诱导的血清能够中和天然ST₁的毒性，表明工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)有潜力作为预防仔猪黄痢的候选菌株。

同时，由于菌毛抗原K99也是主要毒力因子之一，我们利用PCR和基因定点突变技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增^K88ac、^ST₁突变基因和^LT_B基因，并从大肠杆菌C83539中扩增^K99基因，通过DNA重组技术构建了含有^{K88ac-K99-ST₁-LT_B}融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKKSL4)。酶切和DNA序列分析表明重组质粒pXKKSL4含有^{K88ac-K99-ST₁-LT_B}融合基因，基因序列和阅读框正确。优化重组菌株的培养条件实现了高效表达。ELISA结果证实重组菌表达的融合蛋白能被ST₁单克隆抗体、LT_B、K88ac和K99抗体识别。重组菌株的安全性测试表明融合蛋白失去了天然ST₁肠毒素的毒性。动物实验显示免疫保护率超过90%。以上研究表明，我们研究团队成功开发了针对ST₁、LT_B、K88ac和K99等主要毒力因子的四价基因工程灭活疫苗候选菌株，该疫苗不仅解决了ST₁肠毒素的毒性问题，还赋予了其免疫原性，可有效预防由ETEC引起的腹泻。

新型多价和活载体疫苗策略

为克服早期疫苗保护谱窄、免疫原性欠佳等局限性，近期研究侧重于设计更复杂的多价融合抗原，并探索新型活载体递送系统，旨在诱导更全面、高效的粘膜和全身免疫应答。

现代疫苗设计的核心策略之一是构建单一的多聚体融合蛋白，旨在同时引发针对多种粘附素和肠毒素的免疫反应。研究将FaeG（K88的主要亚基）、FedF（F18菌毛的粘附素）与去毒的LT A₂亚基和五聚体LT_B融合，创建了1FaeG-FedF-LT_A2:5LT_B复合物。该设计整合了毒素中和（抗-LT）和粘附阻断（抗-K88和抗-F18）的功能，动物实验证明其可诱导广谱中和抗体，并对K88ac/LT攻击提供有效保护。

鉴于临床分离株常同时产生多种肠毒素，针对所有主要肠毒素（LT、STa、STb）的疫苗尤为重要。通过蛋白质工程，研究人员将丝氨酸63突变（LTR192G）引入天然LT毒素中以消除毒性，然后将其与去毒的STa（STa_A13Q）或STb突变体融合，构建了LT₁₉₂-STa₁₃和LT₁₉₂-STb单体免疫原。口服同时表达这两种免疫原的减毒大肠杆菌可诱导小鼠产生针对LT、STa和STb的特异性粘膜IgA和全身IgG抗体，抗体在体外表现出中和活性。

更近期的研究进一步优化了此类融合。研究人员构建了包含LT_A1-STa₁₃-STb-LT_A2-LT_B-STa₁₃-STb的重组蛋白，旨在增强免疫原性和稳定性。该设计将STa₁₃-STb片段插入LT_A1/_A2亚基之间以及LT_B的C末端，形成双顺反子结构。其在减毒大肠杆菌中稳定表达，可诱导小鼠产生针对LT、STa和STb的特异性血清IgG和粪便sIgA，同时引发Th2偏向的细胞免疫应答。

除了设计单一融合蛋白，利用基因工程减毒细菌作为载体共表达多种异源抗原是另一种高效的多价疫苗策略。研究人员以减毒的福氏志贺氏菌2a为骨架，通过删除其O抗原合成基因（^rfbF）和侵袭相关基因（^ipaBC），使该菌株无致病性且失去血清型特异性。随后，将表达去毒ETEC肠毒素融合蛋白（LT_B-ST_N12S）的基因盒稳定插入其侵袭质粒，创建了候选疫苗株ShigETEC。该疫苗能在小鼠模型中诱导针对多种志贺氏菌血清型的交叉保护，并产生能够中和LT和ST毒素的抗体，显示出其广谱抗菌应用潜力。

新型活载体和递送系统

除了优化抗原本身，使用安全的活细菌载体进行粘膜递送是刺激局部肠道免疫的理想策略。利用食品级乳酸乳球菌（^{Lactococcus lactis}）作为活载体是一个极具吸引力的新型疫苗平台。最近一项研究将突变的LT_A亚基（dmLT_A）、LT_B亚基和关键的K88菌毛蛋白FaeG与表面展示肽融合，构建了三种重组乳酸菌。将其以混合物形式口服接种，不仅能有效预防无母源抗体的断奶仔猪免受F4⁺ETEC感染，而且在妊娠后期给母猪接种，还能通过初乳抗体为哺乳仔猪提供保护。该策略凸显了活载体口服疫苗在刺激粘膜免疫、避免注射应激以及通过“母猪-仔猪”免疫程序提供全周期保护方面的独特优势。

除了乳酸菌，其他精心减毒的细菌也被用作疫苗载体。例如，通过删除毒力基因构建的减毒大肠杆菌菌株可安全用于口服免疫，并有效表达和递送ETEC抗原。研究通过点突变（LTR192G）对肠毒素进行脱毒，并构建了携带多种去毒肠毒素基因（LT、ST_a、ST_b）组合的减毒菌株，从而开发出可同时靶向多种毒素的安全有效的口服候选疫苗。其他研究人员利用基因修复和λ-Red同源重组系统，将多价肠毒素融合基因插入减毒大肠杆菌O142菌株的假基因^yaiT