《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Depicting the dynamic transcriptional and epigenetic landscape of testis development in pubertal Simmental cattle
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研究人员利用整合的单细胞转录组学(scRNA-seq)与单核ATAC测序(sNucATAC-seq)技术，对西门塔尔牛出生后(PN)、青春期前(PP)及青春期(PUB)三个阶段的睾丸组织进行系统分析，鉴定出调控生殖细胞命运转变的核心转录因子，包括E2F1、BC
研究人员利用整合的单细胞转录组学(scRNA-seq)与单核ATAC测序(sNucATAC-seq)技术，对西门塔尔牛出生后(PN)、青春期前(PP)及青春期(PUB)三个阶段的睾丸组织进行系统分析，鉴定出调控生殖细胞命运转变的核心转录因子，包括E2F1、BCLAF1及YY1。研究发现转化生长因子-β(TGF-β)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、表皮生长因子受体(ErbB)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等信号通路参与精子发生过程。支持细胞被划分为三种功能亚型：阶段1与精原干细胞(SSCs)向分化精原细胞(Diff-SPG)转变相关，阶段2对应Diff-SPG向精母细胞(SPC)发育，阶段3与SPC向圆形精子细胞(SPT)转化同步。通过与人类、猪和小鼠的跨物种比较转录组分析，揭示了生殖细胞发育中的保守通路，其中E2F1在SSC向Diff-SPG转变过程中具有显著进化保守性。该研究解析了调控牛睾丸发育中生殖细胞命运转变的分子网络，所鉴定的保守调控因子与通路为克服干细胞系统中的减数分裂障碍提供了新思路，并为哺乳动物精准育种与先进生殖技术的发展奠定基础。
研究背景与意义
西门塔尔牛是全球重要的肉用牛品种，但其睾丸发育的分子与细胞机制尚未被系统阐明。精子发生是维持雄性生育力的核心过程，涉及精原干细胞(SSCs)的增殖、分化及减数分裂，这一过程受到生殖细胞与体细胞（如支持细胞、间质细胞）的精密调控。目前针对肉牛精子发生的系统研究相对匮乏，现有工作多局限于单一组学技术，缺乏对转录与表观遗传调控的整合分析，亦未深入探讨体细胞在精子发生中的作用及跨物种保守性。因此，构建西门塔尔牛睾丸发育的动态分子图谱，对于揭示生殖细胞命运决定的核心机制、提升育种效率及发展生殖生物技术具有重要意义。该研究成果发表于《Journal of Animal Science and Biotechnology》。
关键技术方法
研究人员采集了7头西门塔尔牛在出生后(PN)、青春期前(PP)及青春期(PUB)三个关键发育阶段的睾丸组织作为样本队列。采用整合的单细胞转录组学(scRNA-seq)与单核ATAC测序(sNucATAC-seq)技术，结合生物信息学分析（包括细胞聚类、差异基因表达、SCENIC转录因子调控网络分析、Monocle伪时间轨迹分析、CellChat细胞通讯分析及SAMap跨物种比较），系统描绘了睾丸细胞的转录与染色质可及性动态变化。
研究结果
睾丸细胞类型鉴定与分析
通过整合scRNA-seq与sNucATAC-seq数据，研究人员在西门塔尔牛睾丸中鉴定出9种主要细胞类型，包括精原细胞(SPG, DAZL+)、精母细胞(SPC, SPATA16+)、圆形精子细胞(SPT, PRM1+)及支持细胞(SOX9+)、间质细胞与管周肌样细胞(IGF2+)等体细胞。动态分析显示，生殖细胞比例随发育显著上升，精母细胞在青春期占比达68.53%，而体细胞比例相应下降。研究还发现了多个新的细胞类型特异性标记基因，如NT5DC1（精原细胞）、DNAH14（精母细胞）及ADGRG1（支持细胞）。
西门塔尔牛精子发生阶段特异性核心转录因子
通过对生殖细胞的精细分群，研究人员将其划分为6个亚群：精原干细胞(UCHL1+)、分化精原细胞(MKI67+)、早期精母细胞(MEIOB+/SYCP1+)、晚期精母细胞(MLH1+)、早期圆形精子细胞(TEX35+)及晚期圆形精子细胞(SPEM1+)。整合多组学与SCENIC分析鉴定出E2F1、BCLAF1、FOXO1、YY1等核心转录因子，其功能扰动实验证实这些因子对精原细胞的增殖与干性维持至关重要。
生殖细胞命运转变的关键基因与信号通路
伪时间轨迹与Mfuzz共表达分析揭示了35个沿发育动态变化的基因模块。蛋白互作网络分析表明，精原细胞窗口富集Notch、Ras及TGF-β信号通路（核心因子E2F1、RUNX3）；精母细胞窗口涉及ErbB、促性腺激素释放激素(GnRH)及Hippo通路（核心因子GATA1、EGR1）；精母细胞向圆形精子细胞转变则依赖BDP1、HIC1等因子，并富集于“精子发生”与“精子鞭毛组装”功能项。
支持细胞通过特异性信号通路调控精子发生
支持细胞被分为三个阶段：阶段1（出生后为主，标记基因HNRNPH1、KLF7）通过TGF-β、AMPK及FOXO信号通路支持精原干细胞向分化精原细胞转变；阶段2（青春期前为主，标记基因LDAF1、BEX5）激活MAPK及Hippo通路，介导分化精原细胞向精母细胞发育；阶段3（青春期为主，标记基因DEFB119、TNP2）则与精母细胞向圆形精子细胞转化相关。
间质细胞与管周肌样细胞的发育特征
间质细胞分为胎儿型（INSL3+、RXFP2+）与成人型（HSD17B3+、CYP11B1+）。研究发现胎儿型间质细胞在出生后持续存在并逐渐减少，成人型在青春期前达到峰值。成人型间质细胞与管周肌样细胞共享“肌肉细胞骨架”、“松弛素信号通路”等功能特征，提示二者可能源自共同的前体细胞。
体细胞与生殖细胞的动态细胞间通讯
细胞通讯分析显示，出生后阶段以支持细胞（阶段1）通过WNT、CCL、IGF及TGF-β通路与精原干细胞互作；青春期前阶段，间质细胞与管周肌样细胞通过NPR2通路作用于分化精原细胞；青春期阶段，间质细胞与管周肌样细胞通过CCL及IFN-1通路、支持细胞（阶段3）通过IL6及LIFR通路共同参与精子发生。
跨物种比较揭示生殖细胞发育谱系的核心转录因子
通过与人类、猪及小鼠睾丸单细胞数据的整合分析，研究人员发现内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞在物种间高度保守。伪时间轨迹分析证实牛与猪的生殖细胞发育程序具有高度相似性。保守基因的功能富集显示，E2F靶点与TGF-β信号通路在精原干细胞向分化精原细胞转变中普遍保守，ErbB通路在精原细胞向精母细胞阶段富集，“精子发生”相关术语则在精母细胞向圆形精子细胞阶段显著富集。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究首次构建了西门塔尔牛青春期前睾丸发育的单细胞转录图谱，证实精原细胞增殖主要发生在青春期前阶段，精母细胞在出生后已存在但延迟至青春期前启动减数分裂，这一长准备期可能为加速育种提供了潜在靶点。支持细胞的三阶段划分及其阶段特异性信号通路（TGF-β、AMPK、MAPK）的揭示，深化了对体细胞主动调控生殖细胞发育的认识。跨物种比较进一步验证了E2F1、FOXO1等核心转录因子的进化保守性及物种特异性适应机制。
结论部分强调，本研究通过整合scRNA-seq与sNucATAC-seq技术，系统解析了西门塔尔牛睾丸发育中生殖细胞命运决定的调控网络，证实了精子发生是一个受生殖细胞内源转录因子（如E2F1、FOXO1）与体细胞（支持细胞、间质细胞）外源信号通路（TGF-β、AMPK、MAPK）共同调控的多层协同过程。首次在牛中鉴定出三种功能性支持细胞亚型，并证实了胎儿型间质细胞在出生后的持续存在与逐渐消退。这些保守调控机制的揭示为深入理解牛精子发生的分子基础及制定提高生殖效率的策略提供了新的理论依据。
