《Apoptosis》：Single-cell profiling and machine learning identify cuproptosis-related fibroblast subpopulations and fibrogenesis modulator AEBP1 in endometriosis
编辑推荐：
子宫内膜异位症（EMS）以进行性纤维化为特征，且治疗选择有限。铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性调节性细胞死亡形式，虽在多种病理状态中被报道，但其在EMS成纤维细胞介导的纤维化进展中的作用尚不清楚。研究人员分析了来自正常、在位及异位子宫内膜组织的单
子宫内膜异位症（EMS）以进行性纤维化为特征，且治疗选择有限。铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性调节性细胞死亡形式，虽在多种病理状态中被报道，但其在EMS成纤维细胞介导的纤维化进展中的作用尚不清楚。研究人员分析了来自正常、在位及异位子宫内膜组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以评估铜死亡相关基因（CRG）活性及成纤维细胞异质性；通过拟时序分析、细胞通讯分析及高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）识别疾病相关成纤维细胞状态及候选纤维化相关基因；应用机器学习方法筛选候选枢纽基因；在子宫内膜 stromal cells（基质细胞）中进行功能验证，并利用小鼠EMS模型评估铜螯合剂四硫钼酸（TTM）的作用。结果显示，升高的CRG活性富集于一个具有促纤维化转录特征的独特成纤维细胞亚群；网络与机器学习分析一致地将AEBP1确定为与铜死亡特征相关的候选成纤维细胞枢纽基因。体外实验中，CuCl2联合elesclomol处理与AEBP1及纤维化标志物表达升高相关，并伴随β-catenin通路相关蛋白的变化，而敲低FDX1或AEBP1可减弱这些效应。体内实验显示，TTM治疗降低了异位病灶负荷、纤维化标志物表达及胶原沉积。研究表明，铜死亡相关分子改变与EMS中成纤维细胞活化及纤维化进展相关，靶向铜代谢可能具有限制病灶纤维化的治疗潜力。
论文解读：靶向铜死亡-AEBP1轴调控子宫内膜异位症纤维化机制
一、研究背景与立题依据
子宫内膜异位症（Endometriosis, EMS）是一种常见的妇科疾病，病理特征表现为异位内膜组织在子宫外生长，伴随严重的盆腔疼痛、不孕及进行性纤维化。目前临床治疗主要依赖激素药物和手术切除，但难以有效逆转或阻止纤维化进程，导致高复发率。纤维化的核心效应细胞是肌成纤维细胞（Myofibroblasts, MFBs），其来源包括成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（FMT）等，然而驱动EMS中MFB分化的上游信号及细胞异质性尚未明确。
近年来，铜死亡（cuproptosis）作为一种新型铜依赖性程序性细胞死亡方式被揭示，其机制涉及铜离子积累导致脂酰化TCA循环蛋白聚集及线粒体功能受损。异常铜代谢已被证实与心脏、肝脏等器官的纤维化相关，但在EMS纤维化中的作用仍是空白。此外，基因AEBP1（Adipocyte Enhancer-Binding Protein 1）在多种纤维化疾病中被报道为调控因子，其在EMS中的表达与功能亦未可知。传统 bulk 转录组学难以解析细胞类型特异性的铜死亡响应，因此，本研究整合单细胞测序、机器学习与实验验证，旨在阐明铜死亡相关成纤维细胞亚群在EMS纤维化中的作用及AEBP1的调控功能。
二、关键技术方法概述
本研究构建了包含15例正常子宫内膜（对照组）及15例配对EMS患者（在位、异位）的组织队列。利用公共数据库（GEO）获取单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE179640、GSE5572238）及 bulk 转录组数据（GSE7305、GSE11691）。通过 Seurat、Harmony 进行单细胞质控与整合，定义细胞亚群。采用 AUCell 算法计算细胞水平的铜死亡评分（基于16个CRG基因集），并利用 hdWGCNA 构建基因共表达网络。结合随机森林（RF）、LASSO 及 SVM-RFE 三种机器学习算法筛选枢纽基因。功能验证层面，在体外使用人子宫内膜基质细胞进行基因敲低（FDX1、AEBP1）及铜处理（CuCl2+elesclomol），检测纤维化标志物及β-catenin通路；在体内采用小鼠EMS模型评估铜螯合剂四硫钼酸（TTM）对病灶纤维化的干预效果。
三、研究结果与发现
（一）单细胞图谱揭示EMS中成纤维细胞异质性及CRG活性富集
通过对正常、在位及异位子宫内膜组织的 scRNA-seq 分析，研究人员成功解析了子宫内膜微环境的细胞组成。聚焦于成纤维细胞群体，发现其具有显著的异质性。利用 AUCell 算法计算铜死亡相关基因（CRG）活性显示，异位病灶中的成纤维细胞表现出更高的铜死亡评分。进一步亚群分析鉴定出一个特定的成纤维细胞亚群（CRG-high 亚群），该亚群高表达促纤维化基因，且主要富集于异位病灶中。这表明EMS微环境中的铜死亡相关信号可能特异性驱动了促纤维化成纤维细胞的活化。
（二）细胞轨迹与通讯提示CRG-high成纤维细胞的致病潜能
拟时序分析（Monocle2）描绘了成纤维细胞的分化轨迹，发现 CRG-high 成纤维细胞聚集在轨迹的末端，提示其处于更“活化”或“终末分化”的状态，可能更倾向于分化为分泌细胞外基质（ECM）的肌成纤维细胞。细胞通讯分析（CellChat）进一步揭示，CRG-high 成纤维细胞与其他细胞类型（如免疫细胞、上皮细胞）的相互作用增强，特别是通过 TGF-β、WNT 等已知促纤维化信号通路，表明该亚群在微环境细胞间信号传导中扮演活跃角色。
（三）网络分析与机器学习共同锁定枢纽基因AEBP1
为筛选关键调控因子，研究团队对 CRG-high 成纤维细胞进行了高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA），识别出与CRG活性高度相关的基因模块。从该模块中提取出 top 120 个枢纽基因，并将其与 bulk 转录组数据（EMS vs. normal）进行机器学习联合分析。随机森林（RF）、LASSO 回归和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）三种算法一致将AEBP1列为排名最高的候选基因。AEBP1在异位病灶成纤维细胞中高表达，且与铜死亡特征及纤维化标志物表达呈正相关，因此被确定为后续功能验证的核心靶点。
（四）体外验证：铜死亡诱导AEBP1表达并促进纤维化 via β-catenin
在永生化人子宫内膜基质细胞中，研究人员使用铜离子载体 elesclomol 联合 CuCl2处理以诱导铜死亡相关表型。结果显示，该处理显著上调了AEBP1及经典纤维化标志物（如 α-SMA、胶原蛋白）的表达，同时检测到 β-catenin 通路关键蛋白的核转位及表达变化。当敲低铜死亡关键基因FDX1或AEBP1后，铜诱导的纤维化标志物上调和 β-catenin 通路激活均被显著抑制。这表明铜死亡通过AEBP1调控 β-catenin 信号，进而驱动子宫内膜基质细胞的纤维化反应。
（五）体内干预：铜螯合剂TTM缓解小鼠EMS模型病灶纤维化
在EMS小鼠模型中，腹腔注射铜螯合剂四硫钼酸（TTM）以降低体内铜水平。结果显示，TTM治疗组小鼠的异位病灶体积显著减小，病灶内胶原沉积（Masson染色）及纤维化标志物表达明显降低。这一结果在活体水平证实，靶向铜代谢能够有效缓解EMS相关的病灶生长和纤维化进程，为铜代谢干预作为EMS潜在治疗策略提供了临床前证据。
四、讨论与结论
本研究首次在单细胞分辨率下系统揭示了子宫内膜异位症中铜死亡相关成纤维细胞亚群的存在及其在纤维化进展中的核心作用。通过多组学整合分析，鉴定出AEBP1是连接铜死亡信号与纤维化表型的关键枢纽基因。机制上，铜死亡诱导的纤维化部分依赖于AEBP1介导的 β-catenin 信号通路激活。
研究结论（译文）：铜死亡相关分子改变与子宫内膜异位症中成纤维细胞活化及纤维化进展相关。靶向铜代谢可能具有限制病灶纤维化的治疗潜力。
该研究不仅深化了对EMS纤维化机制的理解，也为开发以AEBP1或铜代谢为靶点的新型抗纤维化疗法提供了理论依据。论文发表于细胞凋亡领域期刊《Apoptosis》，突出了细胞死亡新模式在妇科疾病病理进程中的重要性。
