《Neurochemical Research》：Unfolded Protein Response in Glioblastoma: Mechanisms of Proteostasis, Tumor Adaptation, and Therapeutic Relevance
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胶质母细胞瘤（Glioblastoma， GBM）是一种侵袭性脑肿瘤，可迅速对标准临床疗法产生耐药性。GBM的肿瘤微环境极具侵袭性，其特征是缺氧、活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）水平升高和严重的代谢应激。这些条件促进蛋白质错误
胶质母细胞瘤（Glioblastoma， GBM）是一种侵袭性脑肿瘤，可迅速对标准临床疗法产生耐药性。GBM的肿瘤微环境极具侵袭性，其特征是缺氧、活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）水平升高和严重的代谢应激。这些条件促进蛋白质错误折叠，尤其在内质网（Endoplasmic Reticulum， ER）中，从而引发内质网应激。未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response， UPR）是一种适应性信号通路，可缓解内质网应激、恢复蛋白质稳态（proteostasis）并促进细胞存活。UPR信号通路的激活为GBM细胞在这些不利条件下提供了生存优势。该信号通路与GBM的耐药性和恶性进展密切相关。此外，抑制UPR传感器（UPR sensors）表现出抗癌效应，突显了它们作为GBM治疗靶点的潜力。本综述阐述了UPR传感器的生物学功能及其在GBM发病机制和治疗反应中的作用。
引言
蛋白质是维持内环境稳定所必需的多种生理和细胞过程的关键调节因子。蛋白质功能的实现依赖于其合成后获得正确的三维结构、随后的翻译后修饰以及精确的亚细胞定位。当蛋白质折叠受损时，会损害蛋白质功能，从而破坏蛋白质稳态，进而破坏细胞稳态。由于蛋白质在细胞过程中的重要作用，细胞进化出了复杂的质量控制机制来维持蛋白质稳态。在各种应激条件下，蛋白质稳态的扰动会增加错误折叠多肽的负担。作为分子伴侣的热休克蛋白（Heat-shock Proteins， HSPs）在此过程中发挥重要作用，它们促进新生肽链的正确折叠，促进错误折叠蛋白质的重折叠，或将不可逆损伤的蛋白质导向降解途径。当细胞应激持续存在，导致错误折叠蛋白积累超过伴侣系统的容量时，另一种适应机制——未折叠蛋白反应（UPR）被激活，以恢复内质网中的蛋白质稳态。内质网是蛋白质折叠和蛋白质稳态最重要的细胞器，错误折叠的蛋白质会在此处积累，触发UPR通路。这种适应性信号网络通过抑制翻译、增强伴侣蛋白表达和促进降解途径来恢复蛋白质稳态。然而，当内质网应激持续存在时，相同的信号传导会导致促凋亡输出。因此，UPR是决定细胞生存与死亡平衡的核心决定因素。
胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤受到来自肿瘤微环境和治疗手段的多种应激源的影响。这些应激源增加了GBM细胞中的蛋白质折叠负担，导致错误折叠或受损的蛋白质在内质网内积累。在此背景下，UPR信号促进GBM细胞的蛋白质稳态，从而促进细胞对应激的适应。在GBM中，内质网应激诱导的UPR激活也与耐药性和肿瘤进展相关。此外，靶向UPR的方法已在GBM细胞中显示出抗癌效果，促使人们不断努力对该通路进行治疗性调节。本综述描述了UPR传感器的生物学功能，并考察了它们在GBM病理生物学和治疗反应中的机制作用。
未折叠蛋白反应
UPR由内质网膜上的传感器蛋白检测到内质网腔中的错误折叠蛋白质而启动。在基础条件下，内质网驻留伴侣蛋白GRP78/BiP与UPR传感器蛋白（包括IRE1、PERK和ATF6）结合，使其保持非活性状态。在内质网应激时，GRP78/BiP优先结合错误折叠的蛋白质，导致其与这些传感器解离，从而启动UPR信号。该反应机制包括伴侣蛋白的合成、mRNA降解和蛋白质合成的抑制，从而减少内质网腔中额外错误折叠蛋白质的积累。当应激条件不复存在时，几种反馈机制会终止UPR。然而，持续的内质网应激可引发细胞凋亡或自噬。肌醇需求酶1（Inositol-requiring enzyme 1， IRE1）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（Protein kinase RNA-like ER kinase， PERK）和激活转录因子6（Activating transcription factor 6， ATF6）参与了UPR机制的激活（）。
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IRE1信号通路：IRE1是一种I型跨膜蛋白，包含蛋白激酶和内切核糖核酸酶结构域。其寡聚化导致同源二聚体结构中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域的自磷酸化，并激活其内切核糖核酸酶结构域。激活的内切核糖核酸酶结构域对编码转录因子X-box结合蛋白1（XBP1）的mRNA进行剪接，产生稳定且有活性的转录因子XBP1s。XBP1s然后转入细胞核，诱导参与蛋白质折叠和降解的靶基因表达。IRE1激活还诱导mRNA和microRNA降解，减少细胞内的整体蛋白质合成。此外，IRE1激活后，其蛋白激酶结构域磷酸化衔接蛋白TRAF2，从而通过ASK1触发JNK（c-Jun N末端蛋白激酶）激活，进而诱导细胞凋亡。IRE1还通过其下游效应因子XBP1s间接调节多种转录程序，并与氧化应激、DNA损伤反应和细胞分化等过程相关联。
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PERK信号通路：PERK的寡聚化导致其胞质激酶结构域在C末端自磷酸化。激活的PERK磷酸化真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α， eIF2α），从而抑制GDP-GTP交换，在起始步骤阻断蛋白质合成，从而抑制全局蛋白质合成。同时，PERK激活诱导激活转录因子4（ATF4）的表达。ATF4调节XBP1、GADD34和GADD153（也称为CHOP）以及各种凋亡基因的表达。GADD34负责使磷酸化的eIF2α去磷酸化，而GADD153则抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外，PERK信号通过eIF2α磷酸化促进ATF4的选择性翻译，从而调节与氨基酸导入、谷胱甘肽生物合成和细胞抗氧化反应相关的基因。PERK还可以直接磷酸化核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），从而激活有助于在应激条件下维持氧化还原稳态的抗氧化通路。
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ATF6信号通路：ATF6是UPR机制中的另一个传感器蛋白，是一种II型跨膜蛋白。BiP与内质网腔中错误折叠蛋白质的结合导致ATF6通过COPII囊泡转运至高尔基体。在内质网应激期间，ATF6内的二硫键减少促进其单体化并促进其激活。此外，BiP的解离暴露出ATF6腔内结构域内的高尔基体定位序列，使其能够运输到高尔基体。在高尔基体中，ATF6被位点-1和位点-2蛋白酶依次切割，将其含有bZIP DNA结合域的N端片段ATF6(N)释放到细胞质中。该片段易位到细胞核中，并诱导参与蛋白质折叠和质量控制的基因转录，包括伴侣蛋白如GRP78/BiP和GRP94，以及转录因子CHOP。ATF6增强内质网蛋白质折叠能力，促进错误折叠蛋白质的降解，并有助于细胞适应内质网应激。
UPR激活触发各种信号通路，协调细胞对内质网应激的适当反应。细胞内的蛋白质损伤水平决定了是激活蛋白质稳态调节机制，还是细胞发生凋亡或自噬。在此背景下，UPR与NF-κB、Akt和JNK信号通路相互关联，协调广泛的细胞过程。
胶质母细胞瘤
GBM是成人中高度致命的原发性脑肿瘤。目前GBM的治疗包括手术切除，然后进行放疗并同步使用替莫唑胺（Temozolomide， TMZ）。TMZ是治疗GBM的标准化疗药物，是一种属于咪唑并四嗪类的亲脂性烷化剂。在生理pH下，TMZ转化为活性形式MTIC，进而生成甲基重氮离子和AIC。TMZ通过将甲基转移到鸟嘌呤和腺嘌呤碱基上诱导DNA损伤，形成DNA加合物，干扰DNA复制和转录，导致细胞周期停滞和凋亡。此外，TMZ还诱导GBM细胞发生内质网应激，进而激活UPR信号通路（）。正如后续章节所述，PERK和IRE1信号传导有助于TMZ处理的GBM细胞中的UPR激活。对TMZ的耐药性是限制治疗成功的主要因素。因此，改善GBM患者的当前治疗策略仍然是一个重要且积极研究的领域。除分子异质性外，内质网应激、缺氧和氧化应激也参与GBM的发病机制和肿瘤进展。这些因素促进错误折叠蛋白质在细胞内的积累，最初涉及HSPs，随后激活UPR。在这种条件下，UPR信号支持适应性反应，从而增强GBM细胞的存活。如前所述，BiP与传感器蛋白的解离启动UPR信号。在GBM中，BiP表达经常升高，并与肿瘤侵袭性和不良临床结果相关。BiP水平升高增强了GBM细胞应对蛋白质毒性应激的能力，从而促进增殖和疗法抵抗。BiP抑制可损害细胞生长并使GBM细胞对治疗应激敏感，从而将BiP确定为潜在的治疗靶点。然而，GBM中异常的UPR激活不仅源于BiP的改变，还源于UPR传感器蛋白的改变。
GBM中UPR传感器的异常激活
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IRE1
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激酶和核糖核酸酶功能在治疗中的作用：IRE1中同时存在的激酶和核糖核酸酶结构域突显了其作为治疗靶点的潜力。靶向其ATP结合位点可抑制其内切核糖核酸酶活性，从而在U87细胞系和原位GBM肿瘤中产生抗癌效果。例如，抑制剂Z4P可穿过血脑屏障，有效抑制IRE1活性，与TMZ联用时可通过使GBM细胞对TMZ敏感来防止肿瘤复发并提高治疗效果。临床前研究表明，在手术期间通过纤维蛋白-胶原蛋白植入物局部施用IRE1核糖核酸酶抑制剂MKC8866，联合Stupp样治疗方案可提高生存率，并促进肿瘤坏死和凋亡，同时减少巨噬细胞和小胶质细胞浸润。靶向IRE1可能提高GBM治疗的疗效。
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IRE1诱导的细胞凋亡：激活的IRE1可通过XBP1s增加死亡受体CD95/Fas的表达，从而驱动U87 GBM细胞发生凋亡。在A172细胞系中，激活1,4,5-三磷酸肌醇受体可升高胞质钙水平，激活IRE1，最终导致促凋亡因子CHOP核转位。IRE1-CHOP-ERO1α信号轴通过诱导氧化应激促进钙依赖性JNK1激活，导致凋亡性细胞死亡。
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与IGF-1信号通路的相互作用：在GBM患者来源的神经球细胞系中，抑制肌浆/内质网Ca2+-ATP酶可诱导UPR反应。非反应性细胞中IRE1和ATF4过表达，且UPR相关基因的表达水平与IGF-1信号通路成分IGFBP3和IGFBP5的表达相关。IRE1、IGFBP3或IGFBP5的缺失使U251细胞系对该抑制剂敏感。在携带IRE1缺失的GBM细胞中，抑制IGF-1R受体可显著增加对治疗的细胞毒性反应。
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促炎功能：在内质网应激反应中，IRE1还调节各种癌症类型中促炎细胞因子的表达。在GBM中，IRE1信号通过XBP1s和RIDD活性调节泛素结合E2酶的表达，从而促进NF-κB激活，进而增强趋化因子产生并增加髓系细胞向肿瘤微环境的浸润。IRE1激活增加GBM肿瘤中促炎趋化因子CCL2、CXCL2、IL-6和IL-8的表达。因此，高IRE1活性可能与GBM中的促炎肿瘤微环境相关。
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调节增殖：抑制IRE1通过抑制U87细胞系中的增殖信号级联反应发挥抗癌作用。在此背景下，IRE1是调节细胞应激反应中多种信号通路的核心调节因子。靶向该传感器蛋白通过同时抑制与GBM进展和治疗抵抗相关的其他分子通路，显示出显著的治疗前景。表观调节蛋白是EGFR受体的配体，在GBM细胞中高表达并分泌到细胞外。在U87细胞系和人异种移植肿瘤模型中抑制IRE1会导致EREG配体表达类似下降。这种效应归因于IRE1介导的JNK激活。
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IRE1的其他细胞功能：PER1是IRE1介导的mRNA降解的靶标，调节GBM中的生物钟。siRNA介导的U87细胞系中IRE1表达沉默可防止PER1 mRNA切割。在过表达IRE1的GBM细胞中，PER1 mRNA表达降低。在体内GBM模型中，沉默IRE1会增加PER1蛋白水平并减少肿瘤体积和血管生成。在T98G细胞系中，已鉴定出缺氧特异性差异表达基因来筛选潜在的药物靶点。GBM中的缺氧特异性差异表达基因与糖酵解、缺氧反应、细胞粘附，特别是IRE1介导的UPR相关。IRE1通过调节雌激素相关基因的表达来调节U87 GBM细胞对缺氧条件的适应，从而调节GBM细胞在缺氧条件下的适应。
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PERK
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PERK激活与细胞死亡：内质网应激诱导的细胞死亡会抑制GBM细胞的增殖。内质网应激增加U373和A172 GBM细胞中CHOP水平和caspase-3活性。内质网应激激活PERK，进而通过ATF4-ATF3-CHOP轴介导GBM中的细胞凋亡和细胞周期停滞。令人惊讶的是，PERK激活可能并不总是在GBM细胞中诱导凋亡信号。PERK激活导致ATF4介导的下游靶基因的转录调节。RNA聚合酶II亚基POLR2J与ATF4相互作用促进转录激活。在POLR2J表达被抑制的GBM细胞系中，EGFR、p-Akt和c-Myc的蛋白水平下降，导致细胞周期停滞在G0/G1期。因此，GBM细胞增殖减少，上皮-间质转化受到抑制，导致迁移和集落形成能力下降。POLR2J沉默不会使U251和A172 GBM细胞中的UPR失活。相反，eIF2α磷酸化显著升高，表明内质网应激信号仍然活跃。此时，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理可进一步增强GBM细胞中PARP介导的凋亡信号。这些发现表明ATF4下游通路也调节GBM的致癌过程。
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PERK与TMZ反应：PERK激活是决定TMZ在GBM细胞中疗效的关键因素。在TMZ处理的GBM细胞中，PERK/eIF2α/ATF4信号轴显著上调，ATF4介导的SPHK1表达有助于TMZ耐药。相反，该信号通路的持续激活会改变GBM细胞对TMZ的反应。在GBM细胞系中持续内质网应激时，TMZ诱导BiP、ATF4和CHOP表达，导致持续的UPR激活。TMZ通过造成DNA损伤触发GBM细胞凋亡。然而，DNA修复机制可逆转TMZ诱导的DNA损伤。由于内质网应激诱导的UPR激活降低了RAD51表达，DNA修复在GBM细胞中受损。在这种情况下，DNA修复功能的丧失和UPR介导的促凋亡基因的上调是提高TMZ有效性的关键因素。辛伐他汀和TMZ的联合应用已被证明可在GBM细胞中诱导UPR相关事件。这种联合治疗增加了GRP78表达，促进了XBP1 mRNA剪接，并增强了eIF2α磷酸化。值得注意的是，PERK抑制剂GSK2606414显著诱导GBM细胞系的细胞毒性。与辛伐他汀和TMZ联合使用时，PERK抑制进一步降低了U87细胞系的细胞活力，而在U251细胞系中，它没有显示出明显的额外效果。相反，PERK抑制在不同细胞系中差异调节自噬流，表明观察到的细胞毒性可能与自噬依赖性机制相关。UPR激活后的自噬-凋亡转换可能决定GBM中对TMZ的反应性（）。
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PERK与自噬：内质网应激诱导的活性氧积累通过UPR激活触发GBM细胞自噬。自噬通过溶酶体降解清除错误折叠或聚集的蛋白质以及受损的细胞器，从而维持细胞稳态，促进细胞存活。通过UPR激活的自噬可防止细胞凋亡，导致GBM化疗耐药。然而，如果自噬过度降解细胞质，则可能导致自噬性细胞死亡，突显其在细胞存活和破坏中的潜在双重作用。自噬诱导剂洛哌丁胺增加GBM细胞系MZ-54中ATF4转录因子的表达。在其作用机制中，该诱导剂在GBM细胞中诱导网状自噬，其特征是自噬溶酶体和溶酶体靶向扩张的内质网片段。这种情况在GBM细胞中触发自噬性细胞死亡。抑制ATF4表达可消除洛哌丁胺在GBM细胞中诱导的细胞效应。UPR介导的自噬阻断GBM中的细胞凋亡。抑制UPR诱导的自噬可能会增强TMZ对GBM细胞的作用。相反，如果UPR诱导自噬，则可能会降低TMZ的疗效，甚至导致耐药。
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PERK在GSC适应细胞外基质中的作用：PERK传感器的另一个重要特征是其使GBM干细胞样细胞适应不断变化的细胞外基质条件的能力。当GSCs在补充有人血浆的藻酸盐水凝胶中培养时，它们会分化为具有细长形态的高增殖细胞，以适应其环境。这种适应是通过GSC中F-肌动蛋白细胞骨架组织的改变实现的。有趣的是，PERK抑制会降低F-肌动蛋白的表达，而细胞内细胞骨架保持不变。此外，PERK与另一种细胞骨架蛋白细丝蛋白A相互作用，有助于对机械应激的适应性反应。在这些细胞中，PERK还调节细胞外基质蛋白的表达。在PERK被抑制的GSC中，粘连蛋白和张力蛋白的表达水平显著低于对照组，同时波形蛋白表达下降，微管蛋白表达增加。在此背景下，UPR在机械应激下的GSC中被激活，重组细胞内和细胞外细胞骨架结构，使细胞能够适应不断变化的微环境条件。
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ATF6
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在内质网应激反应中的作用：高分辨率蛋白质组学分析确定了GBM中关键UPR调节受体和效应蛋白的表达水平，并提供了关于它们在内质网应激
