基于壳聚糖的西藏小檗（Berberis lycium）盐酸小檗碱纳米制剂增强对MCF-7细胞持续抗肿瘤效应研究

《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》：Chitosan-based nano-formulation of berberine isolated from Berberis lycium enhances sustained anticancer effects in MCF-7 cells

摘要 乳腺癌仍是重大健康挑战，现有靶向治疗手段有限。盐酸小檗碱（Berberine，BBR）是从西藏小檗中提取的生物碱，虽具良好药理活性，但存在溶解度低、生物利用度差等局限。本研究将BBR包载于壳聚糖纳米粒中，旨在提升其溶解度、实现持续释放，并增强抗乳腺癌治疗效能，重点探究其诱导细胞死亡的潜在机制。研究人员从查谟和克什米尔拉乔里地区采集的西藏小檗中分离得到质量分数为4.2%的BBR，所制备的壳聚糖纳米粒（BBRC）平均粒径为114 nm，多分散指数（Polydispersity Index，PDI）为0.4，ζ电位为18.8 mV，包封率达96%±3.25%，载药量为4.8%±3.5%。MCF-7乳腺癌细胞系对BBR的敏感性显著高于纳米BBR（IC50分别为8.4±1.4 μg/mL和9.21±2.1 μg/mL，p<0.05）。体外实验显示，BBRC可实现BBR持续释放达7天，相较于游离BBR，其在抑制MCF-7细胞增殖、改变细胞核形态、阻滞细胞周期及诱导凋亡方面均表现出增强效应。据研究人员所知，本研究是首批评估纳米与游离BBR时间依赖性差异的工作之一。分子对接结果显示BBR与髓样细胞白血病-1蛋白（Myeloid cell leukaemia-1，MCL-1）结合力强（结合能为-7.6 kcal/mol），ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）分析预测该纳米制剂具有良好的药代动力学特性和安全性特征。综上，壳聚糖包封的纳米BBR可提升溶解度、实现持续释放并增强抗乳腺癌活性，显示出其作为一种高效递送系统的潜力。

研究背景与意义

乳腺癌是全球女性癌症死亡的首要原因，2020年全球约228万女性确诊，68.5万人因此死亡。当前临床治疗以手术、放疗及化疗药物为主，但普遍存在耐药性强、靶向性差、选择性低、给药剂量大、生物利用度不足及严重不良反应等问题，极大限制了治疗效果。植物来源的天然产物因不良反应少、可调控多条癌症进展下游通路，已成为抗癌药物研发的重要来源——近40年获批的240种抗癌药物中仅29种为完全合成，过去十年更有多个模拟天然产物药效团的合成药物获批用于肿瘤治疗。西藏小檗（Berberis lycium）的根在传统阿育吠陀医学中被广泛用于癌症治疗配方，其主要活性成分盐酸小檗碱（Berberine，BBR）虽具明确抗癌潜力，但口服生物利用度极低（仅约0.37%进入体循环），且存在溶解度差、稳定性不足、清除速度快等缺陷，严重制约其临床应用。纳米药物递送系统可通过改善药物稳定性、溶解度、循环半衰期及靶向性，为解决上述瓶颈提供新思路。壳聚糖（Chitosan）作为天然阳离子多糖，兼具生物可降解性、生物相容性、亲水性及无毒性，其正电荷特性可促进与带负电的细胞膜相互作用，提升细胞摄取效率，同时可保护药物免受pH及酶降解，实现药物持续释放，是理想的抗癌药物载体。然而目前针对壳聚糖纳米制剂改善BBR药代动力学局限、提升乳腺癌模型中生物利用度及持续释放效应的系统性研究仍较匮乏，尤其缺乏纳米BBR与游离BBR的时间依赖性活性对比数据。为此，本研究从西藏小檗根中分离BBR，采用离子凝胶法制备三聚磷酸钠交联的壳聚糖纳米BBR，系统评估其对MCF-7乳腺癌细胞的抗肿瘤效应及作用机制，相关成果发表于《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》。

关键技术方法

研究人员采集查谟和克什米尔拉乔里地区的西藏小檗根，经阴干粉碎后依次用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇及水提取，取产率最高的水提物经硅胶柱色谱分离纯化得到BBR，通过薄层色谱、高效液相色谱及傅里叶变换红外光谱进行结构鉴定。采用单因素优化法筛选壳聚糖与三聚磷酸钠的最佳配比，通过离子凝胶法制备BBR负载壳聚糖纳米粒（BBRC），利用动态光散射、场发射扫描电子显微镜、X射线衍射及傅里叶变换红外光谱表征其粒径、形貌、结构及表面电荷，测定包封率与载药量，并通过透析袋法评估体外释放曲线。选用MCF-7、HCT-116、PC-3、A549及正常fr-2细胞系，采用MTT法检测细胞毒性，通过克隆形成实验、DAPI核染色、流式细胞术分析细胞周期及凋亡水平。借助PyRx/AutoDock Tools开展分子对接，以SWISSADME、Molinspiration及Protox3工具进行ADMET及生物活性、毒性预测，所有实验独立重复3次，采用GraphPad Prism软件进行统计分析。

研究结果

BBR的分离与表征

从西藏小檗水提物中经硅胶柱色谱分离得到黄色晶体组分BL61，其熔点（146 ℃）、薄层色谱比移值（Rf=0.8）、高效液相色谱保留时间（2.837 min）及傅里叶变换红外光谱峰形均与标准BBR一致，确认为BBR，产率为4.2%（w/w）。

壳聚糖纳米BBR的合成与表征

采用离子凝胶法制备的BBRC平均粒径为114±0 nm，PDI为0.4±0.08，ζ电位为18.8±0.02 mV；场发射扫描电子显微镜显示其为球形，干燥状态下粒径约160±3.2 nm；X射线衍射显示壳聚糖结晶峰减弱，提示BBR成功包载并形成无定形结构；傅里叶变换红外光谱证实壳聚糖氨基与三聚磷酸钠磷酸基团发生静电相互作用，BBR特征官能团存在于纳米粒中。

包封率、载药量与体外释放特征

当BBR与壳聚糖体积比为1:4时，BBRC包封率达96%±3.25%，载药量为4.8%±3.5%，优于其他配比。体外释放实验显示，游离BBR在4天内释放约90%，而BBRC可持续释放超过7天，呈现典型的缓释特征。

体外细胞毒性特征

MCF-7细胞对BBR敏感性最高，IC₅₀为8.4±1.4 μg/mL；BBRC对MCF-7的IC₅₀为9.21±2.1 μg/mL，二者对正常fr-2细胞均无明显抑制作用，IC₅₀均大于85 μg/mL。

克隆形成能力检测

8 μg/mL浓度处理72小时后，游离BBR组平均集落数为5±3.1个/视野，显著低于BBRC组的8±2.6个/视野及对照组的12±3.2个/视野，提示游离BBR对细胞增殖的短期抑制作用更强。

细胞核形态变化

DAPI染色显示，游离BBR处理组每视野平均核畸变数为11±0.5个，显著高于BBRC组的6±0.3个，表明游离BBR可更快诱导细胞核损伤。

细胞周期分析

处理48小时时，BBR组G₀/G₁期阻滞比例为31.1%，高于BBRC组的20.6%；处理72小时时，BBR组阻滞比例升至42%，BBRC组为34.9%，提示游离BBR的细胞周期阻滞效应更迅速。

细胞凋亡分析

处理48小时时，BBR组凋亡细胞比例为60.2%，高于BBRC组的41.2%；处理72小时时，两组凋亡比例分别升至71.4%和65.9%，显示BBRC可实现更持久的凋亡诱导效应。

分子对接与ADMET预测

BBR与抗凋亡蛋白MCL-1的结合能为-7.6 kcal/mol，可与受体氨基酸形成稳定相互作用。Lipinski五规则评估显示BBR符合类药性要求；ADMET预测提示其吸收性能良好，但存在潜在致突变性与肝毒性风险，需进一步实验验证。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次系统对比了纳米与游离BBR的时间依赖性抗肿瘤效应：游离BBR因快速释放可在短期内更显著地阻滞细胞周期、诱导凋亡及核损伤，而BBRC凭借壳聚糖载体的缓释特性，可实现BBR在细胞内持续暴露，延长治疗窗口。壳聚糖的正电荷特性还可增强纳米粒与肿瘤细胞膜的相互作用，有望在体内克服肿瘤基质屏障，提升药物递送效率。分子对接结果提示BBR可能通过靶向抑制MCL-1发挥抗乳腺癌作用，为后续机制研究提供了方向。尽管ADMET预测提示一定安全性风险，但壳聚糖本身的生物相容性及BBR的广谱药理活性仍使其具备较高的临床转化潜力。

结论部分明确，本研究成功从西藏小檗中分离得到高纯度BBR，通过壳聚糖纳米包封有效解决了其溶解度低、稳定性差的局限，实现了BBR的持续释放。相较于游离BBR，纳米制剂在延长药物滞留时间、维持持久抗肿瘤效应方面优势显著，且未增加对正常细胞的毒性。该研究验证了壳聚糖纳米递送系统在改善天然产物生物利用度方面的可行性，为其他植物源抗癌分子的开发提供了新的技术路径。