《Clinical and Translational Medicine》：Unlocking beta cell health: The clinical potential of extracellular vesicles in type 1 diabetes
背景：1型糖尿病（T1D）是一种终身性自身免疫性疾病，以进展性免疫介导的胰岛素生成β细胞破坏为特征，导致永久性胰岛素依赖以及微血管和大血管并发症风险增加。尽管在自身抗体筛查和免疫疗法方面取得了进展，但在早期检测、准确疾病分期、进展预测和治疗反应监测方面仍存在重大临床挑战。目前的生物标志物对实时β细胞应激和免疫活性的洞察有限，限制了及时和个性化干预的机会。
依据：细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型释放的纳米级膜结合颗粒，携带反映其细胞起源和生理状态的蛋白质、脂质和核酸。EV分离、多组学分析和生物信息学的进步使得现在能够从血液和尿液等可获取的体液中详细表征EV货物。这些发展为将EVs定位为在T1D中探究β细胞健康、免疫激活和全身性并发症的最低侵入性平台，同时也提供了一类新型的无细胞免疫调节治疗药物。
内容：本综述综合了当前关于EVs在T1D发病机制及临床转化中作用的证据。研究人员讨论了β细胞和免疫细胞来源的EVs如何参与抗原呈递、免疫激活和炎症放大，以及EV货物特征（蛋白质、miRNAs和其他RNAs）如何反映疾病阶段、进展和异质性。研究人员总结了关于母体、新生儿和尿液EVs作为生命早期和并发症相关生物标志物的新兴数据，并严格评估了T1D中正在进行的基于EV的临床研究。最后，研究人员探讨了干细胞来源和工程化EVs调节自身免疫和保留残余β细胞功能的治疗潜力。
结论：EVs引入了一个具有潜在临床可操作性的信息层，将细胞应激、免疫失调和组织损伤与T1D中可测量的生物标志物和治疗机会联系起来。然而，目前大多数EV应用仍处于临床前或早期试点研究阶段，在大型、纵向患者队列中的验证有限。主要挑战包括生物学异质性、检测重现性以及需要标准化的分离、表征和监管框架。尽管EV技术的快速发展和早期概念验证临床研究支持其长期潜力，但在常规临床实施可行之前仍需大量工作。为实现基于EV的应用的可行临床转化，必须早期考虑与监管框架的一致性，以确保分析有效性、标准化并符合临床和诊断审批路径，同时解决基于EV的治疗药物的安全性、有效性和生产要求。
1 引言（INTRODUCTION）
1型糖尿病（T1D）是最常见的慢性儿童疾病，代表着一个巨大且不断增长的全球健康挑战。根据国际糖尿病联盟的数据，目前约有5.89亿成人患有糖尿病，预计到2050年这一数字将增加46%。截至2024年，全球估计有920万人患有T1D，其中包括180万20岁以下的儿童和青少年。T1D是一种自身免疫性疾病，以胰岛自身抗体作为免疫失调的标志，以及主要由自身反应性T淋巴细胞介导的胰腺胰岛内胰岛素生成β细胞进行性破坏为特征。这种慢性病症需要终身胰岛素替代治疗，其持续负担加上全球患病率不断增加，凸显了对T1D发展风险个体进行筛查和监测的迫切需求。
T1D的定义已发生范式转变，重点关注早期诊断和检测。T1D可根据多种胰岛自身抗体的存在和糖代谢紊乱水平分为不同阶段：第1阶段为血糖正常，第2阶段为糖耐量受损，第3阶段为生化糖尿病伴或不伴症状。代谢检测支撑这一分类。口服葡萄糖耐量试验仍然是检测第2阶段早期糖耐量受损的金标准和最敏感方法，但其效用受到限制，原因包括对幼儿进行该操作的挑战、由于显著的日间变异性导致的缺乏重现性，以及与日常饮食消耗相关的葡萄糖处理缺乏相关性。
糖化血红蛋白（HbA1c）提供了良好的特异性，但对早期T1D诊断的敏感性较低，并且缺乏捕获早期T1D特征性日间血糖波动变异性的能力。连续血糖监测（CGM）可以揭示预测进展的细微血糖波动，但CGM指标需要进一步研究以验证其在T1D分期中的效用。在T1D分期和预测从T1D早期阶段到临床糖尿病的进展速率方面仍存在方法学空白。
由于正在进行免疫疗法试验，以及美国食品药品监督管理局批准Teplizumab用于第2阶段T1D个体以减缓向临床T1D的进展，T1D患者的一级亲属中的胰岛自身抗体筛查和T1D分期正日益被纳入临床实践。然而，目前免疫疗法治疗反应的评估和预测依赖于C肽测量的各种迭代，作为残余β细胞功能的标志物。这种方法的效用有限，因为它是对病理生理过程任何潜在变化的间接标志物，需要在干预过程中重复测量。C肽也不反映内源性β细胞应激。它是一个不能解释T1D病理生理学异质性的标志物，这可能需要对不同个体进行更具体和有针对性的治疗。
近年来，细胞外囊泡（EVs）已成为非常有前景的生物标志物候选者。它们的吸引力源于其反映亲本细胞生理和病理状态的能力、卓越的稳定性以及可从各种体液轻松分离的特点。本综述论文将探讨EVs作为T1D动态生物标志物、监测和进展以及治疗结果（图1）的有前景的作用。本综述面向临床科学家、内分泌学家和转化研究人员， examines the potential role of EV-based biomarkers within secondary and tertiary care pathways, particularly in diabetes and endocrinology clinics, rather than as tools for population-wide primary screening.
EVs是异质的、磷脂双层膜衍生的囊泡，在细胞间通信中发挥关键作用，并将分子信号传递到近端以及远端位置的细胞。EVs根据其起源和大小分为多个亚型。EVs的主要亚群包括外泌体（exosomes）、ectosomes、oncosomes和凋亡小体（apoptotic bodies）。外泌体通常大小为30–200 nm，起源于多泡内体，而中等大小EVs、ectosomes即微粒（MP）和微囊泡（MVs）大小>200 nm，起源于质膜。凋亡小体从经历程序性细胞死亡的细胞释放，大小≥1000 nm。EVs富含广泛的分子货物，包括蛋白质、脂质、信使RNA（mRNAs）和微RNA（miRNAs），反映了其亲本细胞的组成及其起源的微环境。这种独特特征奠定了它们在细胞间通信和多种生物过程中的作用，使EVs成为研究病理状况的具有吸引力和信息量的生物标志物平台。
2 EVs在T1D中：通往β细胞健康的非侵入性窗口（EVs IN T1D: A NON-INVASIVE WINDOW TO Β-CELL HEALTH）
T1D的早期准确诊断对于有效干预和改善患者预后至关重要。检测胰岛自身免疫证据的传统诊断方法主要依赖于胰岛自身抗体组、C肽水平和血糖指标，通常早于临床诊断数年。在此期间，大部分β细胞团块可能不可逆转地丧失，缩小了有效的疾病修饰或预防性干预窗口。追求最低侵入性、高敏感性和特异性的生物标志物是现代医学的关键前沿，特别是对于像T1D这样的复杂自身免疫性疾病。
作为提供亲本细胞健康快照的多样化分子货物的动态载体，EVs已成为非常有前景的生物标志物。EVs被广泛认为是各种自身免疫性疾病的早期生物标志物，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症，在这些疾病中观察到EVs数量、内容包括蛋白质、mRNA和miRNA的变化。在此背景下，一项比较研究报告称，T1D个体的循环EV水平比健康对照增加两倍。然而，该研究未区分早期和晚期疾病阶段。另一项研究也注意到糖尿病患者循环EV水平升高2.5倍，但未指定疾病分期。与这些发现一致，Sabatier等人也报告了T1D个体循环MP水平升高。有趣的是，Garcia-Contreras等人的研究发现健康个体与T1D个体之间循环外泌体丰度无显著差异，且未指定参与者的疾病阶段。在这方面，极少数研究试图检查与T1D各阶段相关的循环EV水平和组成。这凸显了当前知识中的重大差距，并强调了系统的、特定阶段的研究的迫切需求，以确定EV动态如何沿着T1D发展连续谱演变。
另一方面，许多研究强调了T1D中EV分子货物的显著改变。胰腺β细胞释放的EV携带直接反映其起源和生理状态的分子特征。这提供了与传统系统性生物标志物相比前所未有的粒度。例如，源自β细胞的外泌体和总EV已被证明携带自身抗原，如谷氨酸脱羧酶65（GAD65）和锌转运蛋白8（ZnT8）。EV中这些抗原的存在标志着正在进行的针对β细胞的免疫攻击。miRNAs是短的约22 bp长的非编码RNA分子，涉及通过抑制mRNA转录或抑制蛋白质翻译来调节转录后基因表达。细胞miRNAs释放到细胞外空间通常与载体相关，如脂蛋白、核糖核蛋白或EVs。其中，通过外泌体释放到细胞外空间的miRNAs构成循环miRNAs的最大部分。
在此背景下，观察到β细胞暴露于应激源（如炎性细胞因子）会增加外泌体中miR-21-5p的表达。miR-21-5p是一种与凋亡相关的miRNA，特别显示在T1D发病前和新发T1D儿童循环外泌体中增加。因此，EV独特的分子特征准确反映β细胞的生理和病理状态，为其作为T1D早期检测的非侵入性生物标志物使用提供了引人注目的机会。
3 T1D中EVs在免疫激活和抗原呈递中的作用（EVs IN IMMUNE ACTIVATION AND ANTIGEN PRESENTATION IN T1D）
胰腺β细胞与T细胞之间的串扰是T1D发病的中心轴。β细胞不仅是免疫系统的受害者，而且是主动参与者，与T细胞沟通，导致加速其破坏。β细胞中的内质网（ER）应激以及趋化因子表达的上调上调了HLA I类分子的表达，并伴有新抗原的呈递，这吸引了T细胞，T细胞与β细胞上的这些新抗原结合触发凋亡。
除了直接通信，EVs促进了β细胞与T细胞之间的通信。例如，人胰岛来源的总EV已被证明可直接激活T1D患者的T细胞和B细胞，导致GAD65自身抗体产生增加，从而直接将它们牵连到对自身抗原的特定免疫反应中。此外，ER应激等条件增强β细胞分泌EV。这些应激诱导的EV携带关键的免疫调节伴侣蛋白和自身抗原，随后呈递给抗原呈递细胞，有效启动和放大免疫反应。同样，暴露于促炎细胞因子的β细胞产生富含CXCL-10的外泌体，其与自身反应性T细胞上的CXCR3受体结合。这种结合促进T细胞向β细胞的趋化性，从而延续炎症反馈回路并促成β细胞死亡。总之，这些发现强调EVs作为不可或缺的信使，从根本上促进了T1D中胰腺胰岛细胞与免疫系统之间的破坏性串扰。这种复杂的EV介导的对话使它们成为T1D疾病发病机理的核心参与者，并突出了它们作为早期疾病诊断生物标志物的潜力。
4 T1D中EVs作为免疫调节剂（EVs AS IMMUNOMODULATOR IN T1D）
EVs在T1D中日益被认为是 potent的免疫调节剂，塑造针对β细胞的免疫反应并影响疾病进展。虽然来自垂死β细胞的EV被证明有助于自身免疫，但最近的研究也强调了源自β细胞的EV的保护作用。用胰腺β细胞凋亡小体（NIT-1）脉冲处理的树突状细胞在NOD小鼠中诱导抗原特异性耐受，有效预防T1D。通过胞葬作用促进外周耐受途径，该疗法减少了胰岛炎并在NOD小鼠模型中维持血糖正常，为自身免疫疾病提供了潜在的细胞疗法。程序性死亡-1（PD-1）是在活化的免疫细胞上发现的抑制性受体，其在与其配体程序性死亡配体1（PD-L1）结合后抑制免疫反应。先前的研究显示了β细胞中PD-L1的表达作为限制免疫细胞破坏的行为。最近的一项研究显示了在自身抗体阳性个体以及近期发病T1D患者中β细胞释放的外泌体表面PD-L1的表达。关键的是，这些循环外泌体PD-L1水平在这些个体中被观察到与C肽相关。除了具有保护性外，EV表面的PD-L1表达水平可用作追踪疾病进展和异质性的生物标志物。
5 T1D中EVs的蛋白质组和转录组分析（PROTEOMIC AND TRANSCRIPTOMIC PROFILING OF EVs IN T1D）
通过封装和展示多样化的蛋白质和各种RNA种类（包括mRNAs、miRNAs和长非编码RNAs），它们再现了其起源细胞的表型，循环EVs提供了通往疾病机制的最低侵入性窗口。EVs的蛋白质组分析允许鉴定差异丰度蛋白质，这可以指示β细胞应激或免疫激活，甚至有助于区分T1D疾病阶段或内型。为了进一步探索外泌体作为T1D生物标志物的潜力，一项发现研究对循环外泌体进行了全面的蛋白质组和磷酸蛋白质组分析，鉴定了相对于对照T1D受试者中181种差异丰度蛋白质和8种磷酸蛋白质。这些独特的外泌体特征与关键细胞过程显著相关，包括免疫激活和MHC II类信号传导。重要的是，通过加权基因共表达网络分析鉴定的特定蛋白质模块证明了与特征性临床特征（如胰腺大小）的显著相关性，强调了它们与T1D病理生理的相关性。
除了前面提到的miR-21-5p，外泌体的转录组学证明了T1D患者循环中miR-375（一种β细胞富集的miRNA）的富集。Giri等人证明暴露于应激源的β细胞释放各种EV亚型，富含免疫刺激性miRNA序列，这可能发挥激活免疫反应和促成T1D发病的作用。从T1D患者获得的EV中富集的其他miRNAs包括miR-29、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-455-5p和miR-185-5p，主要涉及免疫激活的调节。
mRNAs是单链分子，介导遗传信息从核DNA到细胞质指导蛋白质合成的转变。EVs表现出mRNA的选择性富集，这一特征可用于诊断目的和监测疾病进展。例如，Wilms' Tumor 1（WT-1），一种在足细胞中选择性表达的转录因子，对维持肾小球滤过屏障至关重要，在患有糖尿病肾病的T1D患者的循环外泌体中显示mRNA水平升高。这种增加伴随着血管紧张素转换酶mRNA表达的减少。综合的外泌体相关mRNA测序进一步揭示了66种上调和46种下调转录本的差异调节。其中，四种线粒体mRNAs——MT ND2、MT ND5、MT ND3和MTRNR2L12——与T1D相关病理生理过程有关，包括调节β细胞对T细胞介导的细胞毒性的易感性。总之，这些发现强调了EV mRNA分析阐明疾病机制和告知T1D新型非侵入性生物标志物开发的潜力。
6 T1D中的母体和新生儿EV特征（MATERNAL AND NEONATAL EV SIGNATURES IN T1D）
母体和新生儿EV特征日益被认为是生命早期免疫编程和T1D易感性的关键决定因素，对生物标志物发现具有重大意义。母体EV可能作为免疫调节信号的载体，在关键发育窗口期间塑造新生儿免疫发育。最近对母乳来源外泌体的研究确定了T1D母亲与健康对照相比显著失调的miRNA货物。特别是，miR-4497和miR-3178的富集已被证明增强人巨噬细胞中TNF的产生，暗示了由母体外泌体介导的促炎印记机制。这些发现意味着母乳EV相关的miRNAs作为早期免疫教育的功能介质，并将它们定位为反映母体自身免疫状态和潜在疾病风险传输的非侵入性生物标志物。在类似的研究中，泌乳母亲循环外泌体分析揭示了包括miR-146a-5p、miR-26a-5p、miR-24-3p和miR-30d-5p在内的miRNAs丰度增加，这些与免疫调节和胰腺β细胞功能有关。尽管改变的母体系统性EV谱与后代T1D风险之间的直接因果关系仍有待确定，但这些数据共同指向一种扰动 的母体免疫环境，可能使遗传易感婴儿倾向于早期自身免疫轨迹。总之，这些研究强调了循环和母乳来源EV miRNAs作为动态、可获取的生物标志物的潜力，为母体对T1D发病的影响提供机制见解，并为早期风险分层策略奠定基础。
7 T1D并发症和共病中的EVs（EVs IN T1D COMPLICATIONS AND COMORBIDITIES）
糖尿病的全身性意味着持续的高血糖和慢性炎症有助于跨多个器官系统的损伤。T1D经常与各种疾病风险增加相关，如肾病、视网膜病变和其他自身免疫性疾病。T1D中用于筛查共病的传统生物标志物包括用于肾病的微量白蛋白尿、用于视网膜病变的眼底检查和用于心血管功能障碍的血压和血脂谱监测。然而，目前的筛查策略主要设计用于检测临床明显疾病，并且缺乏识别亚临床变化的敏感性，而亚临床变化对于预防疾病进展至关重要。
这加强了需要更敏感和特异的生物标志物，可以检测T1D中并发症的最早迹象，使得能够主动管理而不是对确立疾病的反应性治疗。尿液EVs已成为用于早期检测和监测糖尿病肾病特别有前景的非侵入性生物标志物。从尿液中各种肾细胞类型脱落的EVs携带反映肾系统实时健康和应激的分子货物，通常先于传统标志物（如白蛋白尿）的变化。例如，Lytvyn等人显示尿足细胞来源MP水平比健康对照显著增加，为识别有开发肾脏并发症风险的T1D患者提供了有前景的工具。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是肾功能障碍和肾损伤 的敏感标志物。这种小管损伤标志物已在尿EVs中检测到，并且已被证明是T1D儿科患者早期肾损伤比非EV相关NGAL更频繁和更高的指标。尿外泌体相关NGAL与T1D持续时间和HbA1c水平相关，独立于白蛋白与肌酐的比率。在T1D中，足细胞损伤导致前述WT-1蛋白释放到尿液中。与此相关，受伤足细胞释放的外泌体分析显示WT-1蛋白的存在升高。
类似地，报告了尿外泌体中Cystatin B表达增加和蛋白酶谱改变，这可能作为T1DM中肾损伤的生物标志物。除了EV衍生蛋白质，尿EV内特定的mRNAs和miRNAs显示出显著潜力。例如，观察到miR-145在伴有微量白蛋白尿的糖尿病患者尿外泌体中上调，其增加与蛋白尿发展相关，暗示作为损伤进展生物标志物的作用。
通过尿EV分析早期识别此类细微肾功能障碍对儿科T1D人群尤其关键，基于这些生物标志物的主动管理可能显著改变疾病轨迹，可能延迟或预防晚期肾病及其相关发病率的发生。在T1D患者中，内皮和血小板来源MP的循环水平经常升高，反映了血管系统内正在进行的细胞激活、应激和损伤。重要的是，这些EVs超越其作为损伤指标的作用，并通过传播促炎和促血栓信号积极促成疾病发病机理。例如，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种 potent的促炎分子，在T1D发病机理中起核心作用。它既作为疾病活动的生物标志物，也作为胰腺胰岛破坏的驱动因素。从受损胰腺细胞释放后，HMGB1通过TLR4和RAGE等受体损害调节性T细胞功能并激活炎症信号通路，从而放大自身免疫反应。在T1D个体特别是那些有微血管并发症的个体中，在内皮和血小板MVs中检测到这种报警素水平升高。通过EVs转移此类分子可直接影响的受体细胞，加剧炎症，促进氧化应激和损害内皮功能，从而促成内皮功能障碍的起始和进展。因此，分析这些特定EV群体及其促炎货物为识别处于心血管发病率更高风险的T1D患者提供了有价值的途径。
8 T1D诊断和基于治疗的临床试验中的EVs（EVs IN T1D DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS-BASED CLINICAL TRIALS）
表1总结了在T1D背景下调查EVs的注册临床研究，提供了当前转化景观及其局限性的概述。大多数试验侧重于观察或生物标志物发现框架内的循环血源性EVs，反映了T1D临床EV研究的早期阶段。这些研究通常检查代谢应激、自身免疫特征或早期疾病检测，并且通常嵌入更广泛的生理或干预方案（例如混合餐耐量试验或降脂治疗）内，而不是设计为以EV为中心 的临床试验。与该领域的探索性质一致，许多结果仍未公布或研究正在进行中。
只有少数试验超越生物标志物发现走向治疗或非侵入性应用。这些包括评估间充质干细胞（MSC）来源EVs用于β细胞保存（NCT02138331）和尿来源EVs（NCT06832215）作为β细胞功能的替代物。总之，表1中总结的专注于T1D的研究证明了日益增长的临床兴趣，同时强调了需要设计严谨的、以EV为重点的试验，具有协调的方法和明确定义 的终点，以实现T1D中的临床整合。表1中编译的临床试验在NCBI、ClinicalTrials.gov网站上使用关键词搜索：T1D、糖尿病、EVs、exosomes、MPs和MVs。
正在进行的临床研究的实质部分集中在EVs的诊断潜力上。例如，研究“Circulating Extracellular Vesicles Released by Human Islets of Langerhans”（NCT03106246）旨在表征与胰岛健康和功能相关的血源性EVs，提供与胰腺胰岛相关的EV特征的基 础见解。类似地，“Characterisation of Adult-Onset Autoimmune Diabetes”（NCT03971955）和“Development of Novel Biomarkers for the Early Diagnosis of Type 1 Diabetes”（NCT04164966）是使用血源性EVs识别与β细胞自身免疫和疾病进展相关的蛋白质、脂质或核酸货物的正在进行的研究，可能补充诸如自身抗体检测等既定诊断工具。并行地，一项梅奥诊所研究（CLS-2052106）正在检查T1D进展期间的EV货物动态，特别关注响应糖尿病生成炎症线索的富含CXCL10的β细胞来源EVs。进一步扩展非侵入性方法，一项试验正在调查尿来源EVs作为β细胞功能的生物标志物和潜在治疗药物（NCT06832215），为疾病监测提供高度可获取的策略。
T1D中EVs的治疗探索很大程度上由其转移生物活性货物并以无细胞方式调节免疫和再生途径的能力驱动。鉴于基于EV的治疗的早期阶段，目前的努力主要集中于干细胞来源的EVs，特别是来自MSCs的EVs，已知其
