小鼠肝炎病毒（MHV）属于Betacoronavirus属（Coronaviridae科），历史上是实验室小鼠群体中最常见的病原体之一（M?hler和K?hhl，2009年）。然而，随着特定无病原体（SPF）屏障设施的广泛采用，其在现代SPF设施中的流行程度已大幅降低。MHV主要通过粪-口途径传播，该病毒以其高传染性和环境稳定性而著称。MHV感染可导致多系统疾病，病理表现包括肝坏死、绒毛萎缩性肠炎以及各种其他组织中的免疫介导的损伤（Homberger，1997年；Jiao等人，2024a年）。临床表现差异很大，从急性致死到亚临床或持续性感染都有。重要的是，即使是亚临床感染也会干扰正常的免疫反应，从而影响实验的可重复性，进而损害研究数据的有效性（Pullium等人，2003年）。
因此，尽管MHV的当前流行程度较低，但它仍然是健康监测计划中需要排除的关键病原体，开发灵敏的诊断工具对于保护动物健康和研究完整性至关重要。目前的控制策略依赖于常规的血清学和分子监测，并结合严格的生物安全措施。然而，传统的检测方法如PCR（聚合酶链反应）和ELISA（酶联免疫吸附测定）通常劳动强度大、耗时较长，且不适合快速、现场应用的诊断（Hassan等人，2025年）。因此，开发一种灵敏、快速、适用于现场的MHV分子检测方法对于保护动物健康和确保生物医学研究的完整性至关重要。
MHV是一种单链正链RNA病毒，其基因组大小约为27-31 kb（图1）。病毒颗粒呈复杂的球形，直径约为85 nm，由核衣壳和脂质包膜组成（Bárcena等人，2009年；Garcia等人，2021年）。病毒基因组编码多种结构蛋白和非结构蛋白，包括四种关键的结构成分：刺突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白（Masters，2006年）。由于E、M和N基因（或其编码的蛋白质）在不同MHV菌株间具有高度序列保守性，它们成为分子检测的理想靶标（Li等人，2025年；Parker和Masters，1990年）。
MHV的检测主要依赖于免疫学和分子技术。传统的血清学检测方法，如ELISA和IFA（间接免疫荧光测定），通过检测血清抗体来识别感染动物，具有较高的特异性（Homberger，1997年；Kunita等人，2011年；Mathieu等人，2002年）。然而，由于血清转化窗口期较长，这些方法在早期或亚临床感染阶段容易产生假阴性结果，从而降低了其在早期诊断和无症状携带者筛查中的效果。相比之下，基于核酸扩增的分子检测方法可以直接检测病毒RNA，已成为MHV诊断的金标准。这一类别中的主要方法包括PCR、嵌套PCR、定量实时PCR（RT-qPCR）、逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）（Hanaki等人，2013年；Hu等人，2023年；Li等人，2025年；Matthaei等人，1998年；Yamada等人，1998年）。例如，Wang等人开发了一种RT-RAA检测方法，可在20分钟内完成检测，灵敏度达到4.45 × 101拷贝/μL（Wang等人，2022a）。尽管有这些进展，但这些等温扩增方法在应用于病毒载量极低的样本时仍可能存在灵敏度和一致性的限制。
CRISPR-Cas系统源自原核生物的适应性免疫系统，已被重新用于分子诊断。根据效应复合体的结构，CRISPR-Cas系统分为两大类：I类（I型、III型和IV型）和II类（II型、V型和VI型）（Barrangou等人，2007年；Makarova等人，2020年）。在II类中，效应蛋白在底物识别和机制上有所不同。Cas9（II型）能够识别并切割双链DNA，且没有附带活性，使其在基因组编辑和DNA检测中具有广泛的应用性（Jinek等人，2012年）。Cas12（V型）也靶向DNA，在识别双链DNA后进行位点特异性切割，并激活单链DNA（ssDNA）的非特异性“转切割”作用。这种转切割作用被用于DETECTR等检测平台中，以实现信号放大和可视化读数（Jiao等人，2024b年；Li等人，2018年）。相比之下，Cas13（VI型）靶向RNA，在激活后会对附近的非目标单链RNA分子进行切割，包括标记的RNA报告分子，从而实现无需扩增的荧光检测（Abudayyeh等人，2016年；Gootenberg等人，2017年）。
基于CRISPR-Cas13的诊断技术经常与等温扩增技术（如RAA和LAMP）结合使用，形成“预扩增-CRISPR”级联策略。这种组合方法显著提高了灵敏度，使得检测限可以从皮摩尔（pM）达到阿摩尔（aM）浓度（Li等人，2022年；Wang等人，2022b年；Yang等人，2023年）。利用这一原理，已经开发出多种平台，可以在一小时内完成整个检测过程，并可与侧向流动条结合使用，便于可视化解读，大大增强了其现场应用的可行性（Myhrvold等人，2018年）。值得注意的是，这些系统已成功应用于多种RNA病毒的快速检测，包括猪轮状病毒、埃博拉病毒、Echovirus 11、寨卡病毒和SARS-CoV-2（Mi等人，2025年；Xue等人，2022年；Yang等人，2023年）。这一成功的应用记录凸显了基于CRISPR的诊断技术的稳健性和多功能性，为本研究中建立的MHV检测平台提供了坚实的基础。
无需扩增的CRISPR-Cas13检测方法能够在不进行核酸预扩增的情况下实现特异性RNA靶向和信号放大，简化了反应系统的同时保持了足够的灵敏度（Iida等人，2023年；Shinoda等人，2022年；Shinoda等人，2021年）。为了解决固有的灵敏度限制，通过多重靶向和改进信号放大等策略进一步提升了检测性能（Jiang等人，2024年；Shan等人，2023年；Tian等人，2021年；Wang等人，2026年）。例如，Fozouni等人展示了无需扩增的SARS-CoV-2 RNA检测方法，检测限达到约100拷贝/μL，并可通过便携式荧光设备实现现场读数（Jiang等人，2024年）。因此，无需扩增的CRISPR-Cas13检测方法为MHV和其他RNA病毒的检测提供了一种有前景且高效的方法。
在这项研究中，我们建立了一个基于CRISPR-Cas13a的MHV检测平台，并结合了RAA来提高检测灵敏度。图2展示了检测过程的示意图。系统地筛选了E、M和N基因区域内的十个候选靶点，其中N1靶点表现出最高的灵敏度和稳定性。此外，还开发并优化了一种无需扩增的检测系统。结果表明，多重crRNA引导的识别显著增强了荧光信号并降低了检测限，四靶点组合的检测限达到了3.06 pM，优于双靶点和三靶点组合。总体而言，本研究提供了一种新颖且高效的MHV快速、灵敏、适用于现场检测的方法，为其他RNA病毒的多重、无需扩增的诊断提供了方法学参考。
