《Cell Proliferation》：Bridging Kidney Organoid Innovation and Regenerative Medicine: Current Advances and Future Directions
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慢性肾脏病（CKD）已成为全球重大公共卫生挑战，同时器官供体短缺凸显了对替代治疗策略的迫切需求。干细胞技术的进步使得肾脏类器官（kidney organoid）的构建成为可能，其为模拟肾脏发育、解析疾病机制、支持药物研发及探索再生医学应用提供了创新性平台。然而
慢性肾脏病（CKD）已成为全球重大公共卫生挑战，同时器官供体短缺凸显了对替代治疗策略的迫切需求。干细胞技术的进步使得肾脏类器官（kidney organoid）的构建成为可能，其为模拟肾脏发育、解析疾病机制、支持药物研发及探索再生医学应用提供了创新性平台。然而，组织架构不成熟、血管化不足以及未解决的安全性问题等局限，仍阻碍着其向再生医学的临床转化。本综述总结了肾脏发育的基础原理、当前的体外分化策略，以及调控类器官谱系特化的信号通路与表观遗传机制。研究人员进一步强调了生物工程创新与单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）在建立评估体系、提升结构复杂性中的关键作用。最后指出，现有优化框架主要聚焦于提升分化效率与强化相对受限的谱系特化，可能不足以弥合向临床转化的鸿沟；更具前景的范式转变在于融合生物工程调控与高分辨率功能评估，推动类器官复杂性与生理效用实现同步提升。
1 引言
肾脏是维持体液与电解质稳态及清除代谢废物的核心器官。全球有超过8.5亿人罹患慢性肾脏病（CKD），最终可进展至终末期肾病。尽管器官移植是最有效的治疗手段，但供体严重匮乏极大限制了其临床应用。近年来，干细胞生物学的进展为肾脏替代与修复带来了新契机，肾脏类器官因能在体外模拟肾脏发育与功能而成为研究热点。经过十年发展，研究人员已成功在体外构建出分别模拟肾脏滤过系统与集合系统的肾单位类器官（nephron organoid）与输尿管芽类器官（ureteric bud organoid），并建立了稳定的分化方案且持续优化。这些类器官已在遗传病建模、药物筛选与肾毒性测试中展现出显著的转化潜力。尽管如此，成熟度不足、血管整合受限及治疗用途安全性不确定等问题依然突出。生物工程策略（包括仿生细胞外基质、3D生物打印与器官芯片平台）为提升类器官功能提供了新路径，而作为评估类器官发育状态的关键工具，单细胞转录组学可精准解析细胞组成差异并识别未被表征的发育特征，其与多组学技术的结合有望加速分化策略的优化。本综述旨在整合肾脏发育生物学与类器官构建策略，重点聚焦调控谱系特化的信号通路与表观遗传机制，并结合生物工程进展与单细胞水平评估策略，系统阐明如何更严谨地评估并提升肾脏类器官的结构与分子成熟度。
2 肾脏类器官的兴起与演变
肾脏类器官是由诱导多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）或成体干细胞衍生的三维体外系统，可模拟肾脏关键结构与功能特征，应用于疾病建模、药物筛选与再生医学。其诞生既源于临床需求，也依托于发育生物学的进步：前者凸显了肾脏替代与修复的紧迫性，后者则为体外构建提供了理论与技术框架。
2.1 未满足的临床需求
肾脏通过尿液形成实现血液滤过与水电解质平衡调节以维持全身稳态，肾单位是基本功能单元，由肾小体与连续小管系统构成，负责将滤液加工为终尿。慢性肾脏病以肾脏结构或功能异常持续超过3个月为特征，是全球主要健康负担与致死致残原因之一。现有治疗手段存在明显局限：据2023年全球疾病负担研究，全球肾移植受者约102万人，而透析患者达357万人，供需缺口巨大。透析无法完全替代肾脏核心功能，且伴随高昂成本与生活质量下降。异种移植与跨物种器官发生等替代策略虽被探索，但免疫不相容与长期安全性不确定仍是主要障碍。因此，开发模拟肾脏结构与功能的新型体外模型成为迫切的科学与临床需求，肾脏类器官正是在此背景下发展起来，并在慢性肾脏病机制研究与细胞治疗策略探索中逐步显现进展。
2.2 肾脏类器官构建的发育学基础
肾脏类器官研究的推进根植于对肾脏发育认知的深化。哺乳动物肾脏发育起源于中胚层的中间中胚层（intermediate mesoderm），遵循高度协调且进化保守的过程，最终形成永久肾——后肾（metanephros）。该过程由输尿管芽（UB，源自沃尔夫管）与后肾间充质（MM，包含肾单位祖细胞NPC与基质祖细胞SPC）两类关键祖细胞群的相互作用驱动，二者的动态互作调控分支形态发生、肾单位形成及肾脏高阶结构的建立，同时内皮祖细胞参与血管化与功能成熟。小鼠与人类胚胎肾脏发育研究证实，输尿管芽源自前中间中胚层（AIM），后肾间充质源自后中间中胚层（PIM）。肾脏发育过程的解析不仅深化了对肾器官发生的理解，也为这两类肾谱系细胞的体外诱导明确了路径。
3 肾脏类器官分化的主要方案
过去十年，肾脏类器官技术已从概念走向现实。已建立的诱导方案主要分为肾单位类器官与输尿管芽类器官两类，在此基础上，近期研究进一步聚焦于关键祖细胞群的体外扩增与应用，推动类器官系统从结构重建向功能与转化维度过渡。
3.1 肾单位类器官分化方案
经典的肾单位类器官分化方案通过长期激活Wnt信号诱导后中间中胚层（PIM，肾单位祖细胞NPC的发育起源），随后联合Wnt与成纤维细胞生长因子（FGF）信号刺激，驱动NPC分化为肾单位。核心突破来自Taguchi等人对中间中胚层时空分化命运的解析：其在拟胚体培养体系中，通过降低Wnt激动剂浓度并添加视黄酸（RA）与FGF9，将人iPSC衍生的中胚层诱导为后肾间充质，再与作为间充质-上皮转化（MET）诱导物的小鼠胚胎脊髓共培养，获得了含足细胞与肾小管的类肾单位三维结构。Takasato等人与Morizane等人随后分别建立了从人多能干细胞生成肾单位类器官的系统化方案：Takasato方案利用CHIR99021（Wnt激动剂）证明Wnt信号暴露时长决定中间中胚层的前后模式，所得类器官不仅包含分段的肾单位样结构，还涵盖输尿管上皮、血管内皮与基质细胞等多谱系；Morizane方案采用2D单层培养靶向诱导晚期原条，肾单位祖细胞分化效率可达75%–92%。后续多个研究团队在此基础上建立了多样化的分化体系，核心均依赖CHIR99021、FGF9、B27无血清添加剂与RA的组合调控。
3.2 输尿管芽类器官分化方案
输尿管芽类器官的分化方案出现较晚，核心是通过精准生化调控获得前中间中胚层（AIM）。Taguchi团队明确了利用Wnt激动剂诱导AIM的最佳时间窗口，其激活时长短于诱导PIM所需时长，该发现与Takasato等人的早期观察一致。随后通过分阶段施加小分子（包括BMP抑制剂、RA与胶质细胞源性神经营养因子GDNF），成功获得具备分支能力的输尿管芽类器官。后续研究进一步优化以提升其分支能力：Zeng等人报道了可在体外扩增具3D分支结构的输尿管芽类器官并诱导其分化为功能更成熟的集合管样类器官的培养体系；Shi等人则优化了方案，所得输尿管芽类器官经诱导后可产生含超过95%真实集合管细胞类型的集合管类器官。
3.3 肾单位祖细胞扩增及相关应用策略
在现有分化体系基础上，近年研究不仅关注结构构建，更聚焦于关键祖细胞资源优化，尤其是肾单位祖细胞的高效获取与长期维持。作为肾脏发育的核心祖细胞群，肾单位祖细胞可分化为多种肾单位细胞类型，是推动类器官功能化与应用的关键基础。代表性进展包括可长期扩增的肾单位祖细胞体系的建立：Li等人开发的hNPSR-v2培养体系可实现人胚胎干细胞来源诱导肾单位祖细胞（iNPC）的持续扩增，其在多囊肾病模型中用于小分子筛选，成功鉴定出抑囊化合物，验证了作为药物发现平台的转化潜力；Osafune等人建立的CFY悬浮培养基（含CHIR99021、FGF9与Y27632）可缓解肾单位祖细胞传代过程中的分化潜能丢失，将该类细胞移植入化学诱导的慢性肾脏病小鼠模型可延缓肾损伤进展与衰老，显示出细胞治疗的潜力。但需注意，基于肾单位祖细胞构建的类器官仍缺乏完整的排泄通路结构，整体成熟度有限，在一定程度上制约了其功能模拟能力与临床转化潜力。
4 调控肾脏类器官分化的分子与表观遗传机制
肾脏类器官的体外构建本质上是胚胎发育中多级调控网络的重现，发育信号通路与表观遗传调控协同决定谱系分化的方向、时序与效率。
4.1 肾脏类器官分化的分子信号机制
从发育视角看，肾脏类器官构建围绕三个关键节点：首先将人多能干细胞诱导为中胚层，其次沿前后轴进一步诱导形成前中间中胚层与后中间中胚层，最后分别从前、后中间中胚层衍生出输尿管芽类器官与肾单位类器官。中间中胚层特化起源于原条（PS）的晚期阶段，主要由Wnt与BMP4信号驱动；Wnt信号暴露时长决定中胚层的前后命运，视黄酸梯度也具有调控作用。从后中间中胚层向后肾间充质分化过程中，持续的FGF9信号是维持肾单位祖细胞增殖与持续分化的必需条件；同时，模拟输尿管芽来源的瞬时Wnt信号是催化肾单位祖细胞发生间充质-上皮转化的关键。肾小泡形成后撤除生长因子，结构可自发自组装为连续连接的肾单位节段。Lindstr?m等人深入解析了早期肾单位形成过程中近端-远端轴建立的分子信号，确定Wnt激活联合BMP抑制是关键信号节点，有助于生成更接近体内状态的肾单位结构。输尿管芽类器官诱导则需持续给予视黄酸与BMP抑制剂，后续分支形态发生还需Wnt、FGF与Ret等信号激活，以发育为包含集合管在内的尿液收集系统。
4.2 肾脏发育的表观遗传调控机制
表观遗传调控在协同发育信号通路、调控肾谱系特化与分化中发挥关键作用，当前研究较多聚焦于肾单位祖细胞增殖与肾单位分化。广泛共识认为，全局DNA低甲基化与组蛋白高乙酰化会对上述过程产生不利影响。在肾脏特异性DNA甲基化模式中，DNA甲基转移酶1（DNMT1）是功能性肾单位上皮细胞发育的必需因子；全局DNA低甲基化会破坏祖细胞调控网络，下调Wt1及其下游靶点Wnt4的表达，进而负向调控间充质-上皮转化过程中的Wnt信号，阻碍肾单位形成。组蛋白修饰方面，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）参与调控SIX2表达，促进肾小泡向肾单位发育分化。未分化的肾单位祖细胞处于表观遗传抑制但转录待激活状态：HDAC1/2、EZH2与G9a介导H3K9与H3K27的组蛋白去乙酰化与甲基化，使肾发生位点保持转录沉默，同时RNA聚合酶II在启动子区暂停；当经典Wnt/β-连环蛋白信号激活时，SIX2表达下降，核内累积的β-连环蛋白触发局部染色质重塑，表现为启动子可及性升高、激活性H3K4me3标记富集及H3K27me3/EZH2同步耗竭，从而解除转录抑制，启动驱动肾单位分化与间充质-上皮转化的基因程序。对于输尿管芽，HDAC1与HDAC2是其细胞生长、存活与分支形态发生的必需因子，microRNA也在输尿管芽分支形态发生中发挥重要作用。综上，表观遗传调控通过协调染色质状态与转录活性，与分子信号通路共同构成肾脏类器官分化的核心调控基础。
5 肾脏类器官的生物工程与分析策略
当前肾脏类器官研究的一个普遍共识是其结构完整性与功能成熟度仍显著不足，无法满足临床应用要求。除优化生化诱导方案外，整合生物工程技术是提升结构复杂性与功能表现的核心策略；同时，单细胞测序与多组学分析的进步为类器官系统的系统评估与优化提供了关键工具，二者的融合正推动肾脏类器官从单纯结构重现走向真正的功能重建。
5.1 促进类器官成熟的生物工程策略
为突破传统培养体系的组织限制，生物工程通过工程化构建引入空间控制、多细胞类型整合与物理环境信号，提升组织复杂性，具体策略包括仿生基质、3D生物打印与器官芯片平台，旨在重现天然微环境的关键结构与力学特征，从而促进肾脏类器官的成熟与生理相关性。仿生基质中水凝胶的研究最为广泛，其可定制的黏度与力学性能可模拟天然细胞外基质（ECM）环境：Crean等人将hiPSC来源的肾脏类器官培养于刚度可调的全合成自组装肽水凝胶（SAPH）中，所得足细胞表现出更成熟的基因表达谱，且脱靶细胞类型显著减少；单细胞转录组学分析显示，相较于软Alpha4基质，刚性Alpha5基质条件下的类器官中成熟足细胞标志物（NPHS2、ANXA1、PODXL）表达升高，表明基质力学特性可通过调控祖细胞状态与谱系偏向影响分化效率与类器官成熟。3D生物打印是利用计算机辅助设计构建复杂生物结构的新兴技术，可实现多种细胞与生物活性因子的空间控制：Lawlor等人利用挤出式生物打印生成了具功能性近端小管节段的肾脏类器官，单细胞RNA测序分析显示其肾单位成熟度提升且肾小球结构数量增加，同时支持高通量筛选，提升了类器官在疾病建模与药物筛选中的应用一致性与可重复性。除上述细胞与基质因素外，肾脏组织在体内因滤过功能承受显著的流体剪切力与机械张力，微流控芯片可模拟体内流体流动条件，促进肾脏类器官内内皮细胞网络的形成；实验证实升高的剪切应力可诱导VEGF上调，增加内皮祖细胞数量，并通过血管-小管互作促进小管上皮成熟。总体而言，生物工程策略通过引入特定细胞类型并调控其空间排布，重塑由内皮细胞、基质细胞与细胞外基质构成的局部微环境，同时利用生物材料的刚度与黏弹性等力学特性进一步调控分化效率，为肾脏类器官的渐进性成熟奠定了层级结构-环境功能框架。
5.2 工程化肾脏类器官的应用拓展
在生物工程策略支持下，肾脏类器官的应用正向临床转化延伸，尤其在药物筛选与再生医学研究中。药物筛选领域，工程化类器官因结构与功能更接近生理状态，可提升药物反应评估的准确性：3D生物打印构建的患者来源肾细胞癌类器官的药物测试显示了显著的个体间治疗反应异质性，可精准预测药物敏感性，凸显了其在个体化治疗分层中的潜力；近端小管芯片（PToC）可显著上调肾脏类器官中OAT1/3与OCT2的表达，在阿德福韦与顺铂等化合物的生理药物转运与肾毒性建模中表现优异，结合患者来源iPSC进一步为个性化医疗铺平道路。再生医学探索方面，工程化策略为构建功能性组织单元提供了新可能：3D生物打印构建的类器官结构理论上可作为肾单位补片以增加功能性肾单位数量；此外，水凝胶微环境诱导的肾单位祖细胞衍生分子（iNPC-SM）在顺铂诱导的急性肾损伤模型中已显示出作为无细胞治疗策略的潜力。尽管上述进展拓展了类器官的应用边界，但在大规模生产、标准化控制与长期功能稳定性方面仍存在挑战，在一定程度上限制了其临床转化。
5.3 单细胞测序在肾脏类器官评估中的应用
肾脏类器官领域尚未解决的关键问题之一是建立相对标准化的评估体系，以评价类器官质量与功能成熟度。肾脏组织的高细胞多样性与个体间异质性导致目前对各类肾细胞的数量与分布范围仍缺乏明确共识，这成为描绘发育轨迹与对标类器官保真度的核心障碍，单细胞RNA测序（scRNA-seq）为此提供了强有力的解决方案。该技术可对肾脏类器官进行高分辨率转录组分析，无偏倚识别细胞类型、评估分化保真度并检测脱靶细胞群，克服了批量RNA测序的局限，已被广泛用于评估与优化分化策略：Wu等人首次利用单细胞RNA测序直接比较Takasato与Morizane两种分化方案，发现两种方案均存在非肾细胞（主要为神经元与肌肉细胞），且所谓“输尿管芽及其衍生物”实际为远端小管；Subramanian等人利用该技术探究四种类器官方案在不同iPSC系中的稳健性，发现小鼠肾包膜下移植可减少脱靶细胞形成；Little等人开发了DevKidCC数据分析工具，可直接比较不同类器官方案，对类器官评估至关重要。同时，与健康肾脏单细胞图谱的系统比对可精准评估类器官内关键细胞类型（如肾小球内皮细胞、主细胞、闰细胞、免疫细胞）的相对丰度或缺失情况：Combes等人将人类肾脏类器官与胎儿肾脏单细胞RNA测序数据比对，发现二者关键细胞标志物一致，但类器官中远端肾单位细胞代表性不足，且部分肾单位祖细胞中肌生成基因（MYOD1/MYOG）表达失调，提示其可能通过异常激活肌生成程序维持祖细胞特性，解释了长期培养中脱靶细胞增加而非成熟的现象；Czerniecki等人利用单细胞RNA测序证实，通过高通量筛选构建的肾脏类器官包含关键肾单位细胞类型，但缺乏集合管主细胞与闰细胞，揭示了当前类器官模型的局限。此外，单细胞RNA测序解析细胞异质性的能力使其非常适合绘制类器官发育过程中的分化轨迹与过渡细胞状态：Lindstr?m等人比较了hESC来源类器官与胎儿肾脏中足细胞的转录组，发现肾单位祖细胞标志物的丢失对应足细胞特异性分化的起始，为方案优化提供了指导；其数据还揭示了人类与小鼠肾单位及基质祖细胞在基因表达调控上的物种差异，提示跨物种模型在类器官评估与应用中可能存在局限。在单细胞RNA测序基础上，整合蛋白质组学、代谢组学与空间转录组学的多组学方法已被用于解析肾脏发育轨迹并评估类器官保真度：Liu等人利用高清空间RNA测序（hdST-seq）构建了首个小鼠肾脏高分辨率时空转录组图谱，解析出肾脏器官发生过程中的40个迁移相关细胞-细胞通讯事件；蛋白质组学已被用于表征肾脏类器官的蛋白质组成，评估其与人类肾脏疾病模型的分子相关性；代谢组学分析拓展了研究人员对发育微环境与表型调控关系的理解；在肾脏类器官纤维化模型中，多组学分析显示抑制EZH2可减弱TGF-β1诱导的纤维化基因表达与染色质可及性改变，为肾纤维化提供了潜在治疗策略。综上，单细胞与多组学技术的应用显著提升了肾脏类器官的评估分辨率，可详细表征细胞组成、分化状态与方案依赖性变异，为在肾脏发育与疾病建模背景下评估类器官保真度提供了量化框架；其与生物工程平台的整合，进一步促进了对工程化结构特征及相关微环境信号如何影响细胞状态连续体的解析，而非仅改变终末表型，为剖析类器官异质性来源、指导成熟与可重复性的优化提供了基础。
6 未来展望
在分化方案、生物工程策略与单细胞组学分析的推动下，肾脏类器官已取得实质性进展，正逐步从概念模型向实际应用过渡：例如碱基编辑的多囊肾病类器官模型已被用作药物筛选平台，鉴定出真核生物核糖体选择性糖苷（ERSG）作为潜在治疗候选物，凸显了其在药物发现中的价值；移植领域，常温体外灌注系统已被用于将人类肾脏类器官递送至猪肾脏，实现了移植物存活与免疫反应的体内评估。尽管如此，肾脏类器官在移植应用前仍面临巨大障碍，血管化与功能成熟是最关键的两大挑战：尽管类器官内可形成肾小球样结构，但通常缺乏发育良好且稳定的毛细血管网络，导致内部营养与氧气供应受限，进而制约功能性肾小球滤过屏障的形成，无法完全重现核心肾功能。虽然体内移植与生物工程策略已部分克服这些局限，但达到成人水平的肾功能仍是重大挑战。近期Przepiorski与Little等人开发了在已建立的肾脏类器官生物反应器系统内重建内源性血管生态位的策略，获得了具稳健整合内皮网络的肾脏类器官，尽管血管化类器官中肾小管细胞（尤其是远端小管细胞）比例略有降低，但为体外人类肾脏发生过程中构建血管生态位提供了便捷策略。在成熟度与功能方面，构建具生理意义的肾脏结构不仅需要生成所有必需的肾细胞类型，还需将足够数量的功能成熟肾单位有效整合至统一的集合管系统中，这种结构与功能的整合是重现肾脏生理的核心，也是该领域最艰巨的挑战之一。McCracken等人近期发表的研究首次在人类类器官中实现了正确极化的肾单位结构与集合管样结构的连接，但输尿管芽上皮细胞的生长与形态发生模式仍较随机，其功能效力仍需进一步验证。预计未来与更先进的生物工程技术整合，将能更深层次解析肾脏发育的分子事件，构建更高效稳健的分化方案，模拟适宜的发育微环境，推动肾脏类器官从实验室走向临床。此外，人工智能（AI）正成为揭示肾脏发育机制、加速药物发现的强有力工具：近期研究显示，基于AI的药物发现系统可将命中率提升高达17倍，凸显了其在分析类器官来源的大规模多组学数据集方面的计算与整合能力，有望识别调控肾脏分化的关键调控因子，帮助突破当前发育瓶颈；与自动化平台的整合还可能解决标准化难题，大幅提升肾脏类器官在临床前研究、药物筛选与治疗应用中的转化价值。
7 结论
肾脏类器官技术正在重塑肾脏疾病研究与临床治疗的未来格局。通过在体外重现关键发育线索，肾脏类器官在疾病建模、药物筛选与肾毒性评估、解析人类肾脏发育等方面展现出卓越潜力，最终将推动个性化与精准医疗的进步。然而，结构成熟度有限、功能完整性不足、血管化不充分与批次间变异性等挑战依然存在。正如本综述所讨论的，新兴生物工程策略、多组学技术整合以及人工智能与自动化制造平台的引入，为解决这些障碍提供了可行路径。简言之，持续深化对肾脏发育的认知、优化分化与工程化方法，有望获得更成熟、稳健且功能整合的肾脏类器官，推动其从实验室向临床转化，使基于类器官的肾脏替代与精准治疗更接近临床现实。
