在利什曼原虫（Leishmania donovani）的前鞭毛体（promastigote）和无鞭毛体（amastigote）阶段，特定阶段的差异基因表达会引发适应性变化

《Molecular and Biochemical Parasitology》：Stage-specific differential gene expression leads to adaptive changes in the promastigote and amastigote stages of Leishmania donovani.

Ishana Jha | Basant K. Tiwary

生物信息学系，生命科学学院，本地治里大学

摘要

Leishmania donovani 在两种不同的环境中完成其生命周期：在人体内以非运动性的感染性阿米巴态存在，在沙蝇肠道中以运动性的前阿米巴态存在。尽管生命周期阶段之间的基因表达差异已得到广泛研究，但基因表达的变异性对寄生虫适应性的贡献仍知之甚少。在这里，我们利用批量RNA-seq数据探讨了L. donovani的转录变化，以阿米巴态为参考。差异表达分析后，我们计算了基因间的Wasserstein距离，以捕捉各阶段表达分布的变化。我们发现阿米巴态的转录变化总体上低于前阿米巴态，但在与应激反应、膜蛋白和调控相关的基因中表现出更大的异质性。重要的是，我们识别出一组基因，尽管平均表达变化很小，但它们的表达分布发生了显著变化，而这些变化未被传统的差异表达分析所检测到。这表明，更深层次的调控机制可能被基于平均值的差异表达分析所掩盖。此外，对这两个阶段中注释不足的基因进行了重新注释，发现许多基因具有帮助寄生虫在宿主细胞和媒介中生存的特定功能。总体而言，我们的结果为基因表达的变异性提供了探索性的见解，揭示了在L. donovani生命周期各阶段中平均表达稳定但分布模式发生变化的基因。这些发现共同表明，转录异质性可能构成了一个被低估的调控层，有助于寄生虫在媒介和宿主环境之间的适应。

引言

Leishmania donovani 是属于锥虫科（Trypanosomatidae）的一种动质体原生动物寄生虫。它引起的利什曼病是一种主要被忽视的热带疾病，主要影响低收入和中等收入国家。利什曼病分为三种类型：皮肤利什曼病（CL）、黏膜皮肤利什曼病（MCL）和内脏利什曼病（VL）（Hussein等人，2019年）。该疾病通过感染了Leishmania物种的雌性沙蝇（Phlebotomus sp.）的叮咬传播给人类。Leishmania具有双基因型生命周期，在沙蝇媒介中的细胞外前阿米巴态和人体宿主中的细胞内阿米巴态之间交替（Sunter, J. & Gull, K., 2014; Pareyn, M., Alves, F., Burza等人，2025）。前阿米巴态向阿米巴态的分化涉及遗传、代谢组和形态的重塑，这对寄生虫的生存、侵入免疫系统以及在宿主体内的疾病进展至关重要（Clos, J., Grünebast, J., & Holm, 2022）。根据世界卫生组织的数据，内脏利什曼病在亚洲、非洲和美洲的75个国家仍然流行，2020年印度占全球报告病例的近18%（https://www.who.int/india/health-topics/leishmaniasis）。

高通量转录组学方法，如批量RNA测序（RNA-seq），已被广泛用于研究L. donovani的前阿米巴态和阿米巴态阶段的基因表达变化。这些研究发现了与代谢、应激反应和适应宿主环境相关的阶段特异性基因和通路（Rastrojo等人，2013年；Salloum等人，2021年），为了解寄生虫的阶段特异性代谢、应激反应和生存机制提供了见解（Alcolea等人，2010年；Saxena等人，2007年）。在Leishmania中，由于缺乏基因特异性启动子，转录调控主要是组成型的，基因表达主要在转录后进行调控（Clayton C., 2016年；Lahav等人，2011年；Clos等人，2022年；Sunter和Gull，2017年）。需要注意的是，转录本丰度并不总是与蛋白质水平相关，特别是在Leishmania中，转录后调控起着主导作用。这种独特的调控机制在理解转录本丰度数据时非常重要。在密切相关的物种中，如Leishmania infantum中也报告了类似的阶段特异性转录模式，支持了寄生虫适应机制的保守性（Decuypere等人，2008年；Alcolea等人，2010年）。然而，传统的差异表达方法主要关注平均表达水平的变化，可能无法检测到那些其调控行为体现在表达变异性或分布结构变化而非平均值变化中的基因。

来自不同生物体的系统级和单细胞研究的证据表明，仅通过平均表达的变化无法完全识别基因表达的调控变化。尽管过去几年进行了大量基于RNA的研究，但在传统差异表达分析中，那些在各个阶段中变化微妙或表现出异质表达模式的基因往往被忽略。相反，表达变异性及其分布模式和调控异质性的变化可以揭示参与环境压力、发育转变和表型可塑性的重要基因和通路（Wang & Nabavi，2018年）。对于像L. donovani这样的寄生虫来说，它们适应不同的宿主和媒介相关环境，这种形式的调控可塑性是其在媒介和宿主体内分化和生存的关键组成部分（Clayton C., 2016年；Kumari等人，2023年）。此外，注释不足的基因和蛋白质（被归类为假定的或保守的）进一步复杂化了使用标准富集方法的功能分析。

在这项研究中，我们通过引入基于分布的基因表达异质性测量，扩展了对L. donovani阶段分化的传统转录组学分析。利用前阿米巴态和阿米巴态阶段的RNA-seq数据，我们首先识别了差异表达基因，并进行了功能注释，以表征阶段特异性的转录特征。然后我们应用了基因间的Wasserstein距离（Earth Mover’s Distance），这是一种衡量将一个概率分布转换为另一个概率分布所需最小“成本”的指标（http://infolab.stanford.edu/pub/cstr/reports/cs/tr/99/1620/CS-TR-99-1620.ch4.pdf）。这包括表达分布的变化，主要反映了位置上的差异，以及在较小程度上的分散程度，以及表达值的相对位置。特别是，这种方法允许识别在各种条件下平均表达相当但分布特性不同的基因，而这些基因无法通过传统的差异表达分析捕捉到。在我们的研究中，我们使用Wasserstein距离来识别在生命阶段之间表现出显著“分布变化”的基因，这些基因可能被差异基因表达分析所遗漏。我们的研究中的“异质性”指的是每个生命阶段内生物重复样本间基因表达分布的变化，而不是单细胞变异性。这种方法预计能够捕捉到基因表达的分布特性差异，补充了RNA-Seq分析。这种方法使得能够识别出那些不能仅通过平均表达变化来解释的分布变化，从而揭示了使用传统差异表达框架无法检测到的调控模式。

章节片段

数据获取和预处理

L. donovani 有两种不同的形式：前阿米巴态和阿米巴态。这两个阶段的批量转录组数据来自欧洲核苷酸档案库（ENA），ID为ERP017437。该数据集包括11个配对端样本，分别来自L. donovani的阿米巴态（四个样本）和前阿米巴态（七个样本）。阿米巴态样本来自脾组织，而前阿米巴态是在体外从阿米巴态衍生的寄生虫培养得到的。一个阿米巴态样本和三个

RNA-Seq数据预处理和对齐

所选数据集的整体质量很高，所有样本都符合每碱基的质量和GC含量阈值。读段与L. donovani BPK282A1菌株的参考基因组高效对齐。所有样本的映射率在85%到95%之间。

差异基因表达分析

使用DESeq2对前阿米巴态和阿米巴态阶段进行了差异基因表达分析。共有163个基因在前阿米巴态中显著上调，而411个基因在

讨论

在这项研究中，我们应用了一个综合转录组学框架来检查L. donovani的阶段特异性基因表达模式，旨在探索前阿米巴态和阿米巴态之间的平均表达变化和分布变异性。与之前的转录组学研究一致，我们观察到这两个生命周期阶段之间存在显著的转录差异，反映了在沙蝇媒介和人体宿主中遇到的不同环境条件

未引用的参考文献

(Andrews, 2017, Blighe等人，2025, Clayton, 2019, Downing等人，2011, Hussein等人，2019, Jones等人，2014, Kim等人，2019, Lahav等人，2011, Li等人，2009, Liao等人，2014, Love等人，2014, Martin, 2011, Pareyn等人，2025, Raj和Van Oudenaarden, 2008, Saxena等人，2007, Schuhmacher等人，2024, Sherman等人，2022)

CRediT作者贡献声明

Ishana Jha：概念化、数据管理、正式分析、调查、方法学、验证、可视化、初稿撰写、审阅与编辑。Tiwary Basant Kumar：概念化、数据管理、正式分析、资金获取、调查、方法学、项目管理、监督、资源协调、初稿撰写、审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢印度医学研究委员会（ICMR）（外部特别项目：ID-2021-13559）对这项研究工作的资助。

生成式AI辅助

作者声明他们在手稿中使用了Grammarly进行语法校正。