《Molecular & Cellular Proteomics》：Multidimensional Proteomics Reveals the Pro-apoptotic Mechanism of Platycodin D: Targeting RFC4 to Regulate the Notch Signaling Axis in Non-Small Cell Lung Cancer
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背景与目的：桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）是从传统中药桔梗（Platycodon grandiflorus）中分离得到的主要生物活性皂苷，在非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）治疗中显示出潜在价值，但其
背景与目的：桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）是从传统中药桔梗（Platycodon grandiflorus）中分离得到的主要生物活性皂苷，在非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）治疗中显示出潜在价值，但其具体作用机制尚未明确。本研究旨在阐明PD抗NSCLC的药理机制。材料与方法：研究人员采用热蛋白质组学（thermal proteome profiling，TPP）、分子对接、细胞热位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）及肽中心局部稳定性分析（peptide?centric local stability assay，PELSA）鉴定PD的潜在结合靶点；通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）及免疫共沉淀?蛋白质免疫印迹（immunoprecipitation?Western Blot，IP?WB）探究靶点的下游信号通路；同时对PD处理细胞进行蛋白质组学和泛素组学分析，评估其全局效应。结果：TPP鉴定复制因子C亚基4（replication factor C subunit 4，RFC4）为PD的潜在结合靶点，PELSA进一步明确了二者的结合位点。PD?RFC4复合物通过减少Notch1和Notch3的核转位促进其降解。与对照组相比，PD诱导的差异表达蛋白主要参与铁死亡、泛素化、铂类药物耐药及核糖体相关进程；泛素组学分析显示Notch通路相关蛋白发生泛素化修饰。结论：PD结合并抑制RFC4活性，下调Notch信号通路，最终诱导肿瘤细胞凋亡，是具有NSCLC治疗潜力的天然产物。
本研究发表于《Molecular》，聚焦非小细胞肺癌（NSCLC）治疗困境：NSCLC占肺癌总数80%以上，多数患者确诊时已属晚期，5年生存率不足15%，现有化疗存在不良反应大、耐药机制复杂等问题，亟需挖掘新靶点与新策略。桔梗为中医肺系疾病常用药，其活性成分桔梗皂苷D（PD）在临床前研究中显示出多机制抗肿瘤潜力，但具体靶点与作用通路尚不明确。研究人员通过多维蛋白质组学技术首次发现PD直接结合复制因子C亚基4（RFC4），通过调控Notch信号轴诱导NSCLC细胞凋亡，为天然产物靶向治疗提供了新依据。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：以人NSCLC细胞系A549为核心研究模型，结合公共数据库TCGA与CPTAC的肿瘤转录组与蛋白质组数据；应用热蛋白质组学（TPP）、细胞热位移分析（CETSA）、肽中心局部稳定性分析（PELSA）及分子对接技术鉴定药物靶点；通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）、免疫共沉淀?蛋白质免疫印迹（IP?WB）验证靶点及下游通路；采用全蛋白质组学与泛素组学分析PD处理后的全局蛋白表达与泛素化修饰变化。
研究结果如下：
3.1 PD促进A549与H1299细胞凋亡及细胞周期阻滞
MTT实验显示PD以时间与剂量依赖方式降低NSCLC细胞活力，A549对PD更敏感，后续实验均选用该细胞系。流式细胞术检测证实PD显著升高细胞凋亡比例，并将细胞周期阻滞于G0/G1期，同时减少S期与G2/M期细胞占比，表明PD通过诱导凋亡与周期阻滞抑制NSCLC增殖。
3.2 TPP与PELSA鉴定RFC4为PD的潜在结合蛋白
TPP分析显示PD处理后RFC4的热稳定性显著升高，ΔTm达7.5℃，功能富集提示其参与DNA复制等关键通路。分子对接显示PD与RFC4结合能约为?8.1 kcal/mol，CETSA验证了二者结合后RFC4热稳定性增强。PELSA定位PD主要结合于RFC4的ATP酶相关AAA结构域（AAA domain，IPR003959），该结构域负责ATP结合与水解，参与细胞周期调控等核心过程。
3.3 PD抑制RFC4/Notch信号通路
TCGA与CPTAC数据一致显示RFC4在NSCLC组织中高表达。研究人员发现已知RFC4抑制剂罗米地辛（Romidepsin）与PD共享结合位点，PD处理可显著降低RFC4蛋白水平，同时下调Notch1与Notch3总蛋白表达，并阻碍其胞内段（NICD1与NICD3）的核转位。IP?WB实验证实RFC4可与NICD1及NICD3内源性结合，PD处理分别降低二者结合约20%与30%，提示PD通过抑制RFC4表达并干扰其与NICD的相互作用阻断Notch信号激活。
3.4 PD处理的A549细胞蛋白质组特征
全蛋白质组学共鉴定7007个蛋白，PD处理组筛选出1166个差异表达蛋白，主要富集于FoxO、TNF、p53、Hippo及NF?κB等抑癌通路，同时特异性富集铁死亡与铂类药物耐药通路，与罗米地辛处理后的重叠通路一致，印证二者共享促凋亡表型。
3.5 PD处理的A549细胞泛素组特征
泛素组学共鉴定9983个泛素化位点，对应3330个蛋白。PD处理上调836个蛋白的1230个位点，下调571个蛋白的810个位点。功能富集显示上调泛素化蛋白参与Notch信号通路、铁死亡及DNA复制等进程，其中Notch通路相关蛋白Presenilin?1（PSEN1）、Jagged?1（JAG1）、组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）及Transducin?like enhancer protein 1（TLE1）的特定位点泛素化水平升高，提示PD通过增强Notch通路蛋白泛素化促进其降解。
讨论部分指出，RFC4在NSCLC中高表达且与不良预后相关，既往研究证实其与Notch信号形成正反馈环路促进肿瘤进展。本研究首次揭示PD通过靶向RFC4破坏该环路：PD结合RFC4的AAA结构域抑制其活性，一方面直接降低RFC4蛋白水平，另一方面增强Notch通路关键蛋白的泛素化修饰，减少NICD1与NICD3核转位，最终诱导细胞凋亡。研究同时提示PD可能通过调控铁死亡、逆转铂类耐药等多途径发挥抗肿瘤作用，但RFC4与PD的直接互作细节及体内疗效仍需进一步验证。
研究结论：桔梗皂苷D通过靶向结合复制因子C亚基4（RFC4），抑制其活性并下调Notch信号通路，最终诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，是具有临床转化潜力的天然产物候选药物。
