收集培养基对hTERT永生化间充质基质细胞来源细胞外囊泡生物活性的影响

《Journal of Extracellular Vesicles》：Role of Collection Media on the Biological Activity of Extracellular Vesicles From hTERT-Immortalised Mesenchymal Stromal Cells

　　

研究人员指出，间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）来源的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）因可调节免疫反应、促进组织修复并复现亲本细胞的多种治疗效益，是一类极具前景的无细胞疗法。然而，由于生物与技术层面的变异性，开发标准化、可临床转化的MSC-EV制剂仍面临挑战。细胞来源、供体差异、传代次数及培养条件等因素均会影响EV的产量与功能，而富集方法、纯度及培养基成分进一步增加了EV特异性效应解析的复杂性。尽管既往研究已探讨分离方法与血清污染物的影响，不同收集培养基对EV生物活性的作用仍不明确。本研究采用hTERT永生化MSCs——其保留了原代MSCs的治疗特性——以降低细胞异质性。研究人员将EV分别收集于四种无动物源（xeno-free）培养基中，经切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）富集后，评估其抗炎、抗纤维化、划痕闭合及促增殖潜能，并以经相同TFF处理的未条件化收集培养基作为对照。结果表明，收集培养基显著影响MSC-EV的生物与功能特性，凸显了为标准化EV生产谨慎选择培养基的必要性。该研究推动了EV研究的标准化进程，并为开发稳定、具有临床相关性的MSC-EV产品提供了支持。

该研究针对间充质基质细胞（MSCs）来源细胞外囊泡（EVs）临床转化中的标准化难题展开。当前MSC-EV研究受限于细胞来源异质性、培养工艺差异及下游处理方法的变异性，其中收集培养基成分对EV功能的影响尚未被系统解析，且缺乏针对未条件化培养基的背景控制，导致EV特异性效应难以准确界定。为解决上述问题，研究人员采用hTERT永生化骨髓来源MSCs（BM-MSC/TERT292）以消除供体相关变异，设置四组无动物源收集培养基组合，通过切向流过滤（TFF）富集EV，结合物理表征、表面标志物分析及多维度功能实验，并与经相同流程处理的未条件化培养基对照进行比较，明确了收集培养基对EV产量、纯度及生物活性的决定性作用，为临床级EV产品的标准化生产提供了实证依据。该研究成果发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

本研究采用的主要关键技术方法包括：使用hTERT永生化骨髓间充质基质细胞（BM-MSC/TERT292）作为稳定细胞源；设置四组商业化无动物源培养基组合进行EV收集；采用切向流过滤（TFF）进行EV富集；通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、蛋白质定量及Western blot进行EV物理与分子表征；利用荧光触发流式细胞术及多重微球流式细胞术分析EV脂质组成与表面标志物谱；通过脂多糖刺激的BV-2小胶质细胞抗炎实验、转化生长因子β1诱导的人真皮成纤维细胞抗纤维化实验、人脐静脉内皮细胞划痕愈合实验、成纤维细胞增殖与代谢检测、活性氧清除实验及管形成实验评估EV的多维度生物活性；所有实验均设置经相同TFF流程处理的未条件化培养基（UCM）作为对照，以消除培养基本底效应的干扰。

研究结果如下：

3.1 不同扩增培养基对BM-MSC/TERT292细胞的影响

研究人员将细胞分别培养于Mesencult ACF Plus培养基与含1%或2% RoosterBooster添加剂的RoosterNourish-MSC-XF培养基中。结果显示，含2% RoosterBooster的培养基可支持细胞达到与原代适应培养基相当的群体倍增时间（0.75天/次），而1%添加剂组生长速率显著下降；形态学观察显示，2%添加剂组细胞形态与原代适应组相似，1%组则呈现更显著的异质性与拉长表型。据此选定含2% RoosterBooster的RoosterNourish-MSC-XF与Mesencult ACF Plus作为后续扩增培养基。

3.2 不同收集培养基对BM-MSC/TERT292来源EV的影响

研究人员设置四组收集组合：Mesencult ACF Plus扩增+同培养基收集（Mesencult-EVs）、Mesencult ACF Plus扩增+OptiMEM收集（OptiMEM-EVs）、RoosterNourish-MSC-XF扩增+同培养基收集（Nourish-EVs）、RoosterNourish-MSC-XF扩增+RoosterCollect-EV收集（EV Collect-EVs）。NTA结果显示，Nourish-EVs的粒子释放量最高（1.77×10⁴粒子/细胞/天），其次为Mesencult-EVs、EV Collect-EVs及OptiMEM-EVs；粒子尺寸在各组中无显著差异；纯度（粒子数/蛋白质量）以OptiMEM-EVs与EV Collect-EVs最高。Western blot与TEM表征显示，OptiMEM-EVs与EV Collect-EVs高表达CD81、Syntenin-1及TSG101等EV标志物，ER污染标志物Calnexin几乎不可检出，且无明显蛋白聚集体；而Mesencult-EVs与Nourish-EVs需加载3倍粒子量才可检测到标志物信号，且Nourish-EVs中存在明显蛋白杂质共分离。

3.3 未条件化培养基对照的EV样特性表征

研究人员将四组未条件化培养基经相同TFF流程处理后发现，Nourish-UCM的粒子浓度与对应EV制剂相当，EV Collect-UCM的粒子浓度仅为对应EV制剂的1/10，OptiMEM-UCM与Mesencult-UCM分别为1/3与1/2；蛋白含量检测显示，Mesencult-EVs的蛋白浓度较对应UCM升高近6倍，EV Collect-EVs升高约3倍，而Nourish-EVs与UCM无显著差异；脂质染色流式结果显示，EV Collect-EVs与OptiMEM-EVs的脂质阳性粒子数显著高于对应UCM，Nourish-EVs则低于对应UCM，表明培养基本底成分会显著干扰EV定量与定性结果。

3.4 不同收集培养基来源EV的表面标志物谱

多重微球流式分析显示，不同培养基来源的EV具有高度批次重复性，但表面标志物谱存在显著差异。OptiMEM-EVs与EV Collect-EVs高表达经典EV标志物CD9、CD63、CD81及MSC特异性标志物CD73、CD90、CD105；Mesencult-EVs与Nourish-EVs的上述标志物表达显著降低，且Nourish-EVs富集血小板/内皮细胞标志物CD31、CD41b、CD42a与CD62P，提示其共分离了培养基中的人血小板裂解物来源成分。

3.5 收集培养基对BM-MSC/TERT292来源EV生物活性的影响

抗炎实验中，OptiMEM-EVs在所有测试浓度（1×10⁸–2×10⁹粒子/毫升）下均表现出与地塞米松相当的NO分泌抑制率（最高73.5%），且呈剂量依赖性；Nourish-EVs在2×10⁹粒子/毫升浓度下反而促进NO分泌（升高26.4%）。抗纤维化实验中，Nourish-EVs与EV Collect-EVs的α-SMA抑制率最高（分别为39.5%与36.3%），OptiMEM-EVs无显著活性。划痕愈合实验中，EV Collect-EVs与Mesencult-EVs的24小时划痕闭合率最高（分别为32.1%与28.8%），Nourish-EVs活性最低（12.0%）。

3.6 未条件化培养基的生物活性

抗炎实验中仅Mesencult-UCM表现出显著NO抑制（35.8%）；抗纤维化实验中，Nourish-UCM与Mesencult-UCM均有活性，OptiMEM-UCM与EV Collect-UCM无活性；划痕实验中各组UCM均无显著促愈合作用，仅Nourish-UCM轻微降低划痕面积（9.5%）。

3.7 EV与未条件化培养基对细胞增殖与代谢的影响

代谢活性（Alamar Blue）检测显示，Mesencult-EVs的提升幅度最高（30.8%），其次为EV Collect-EVs（21.9%）、OptiMEM-EVs（12.9%）与Nourish-EVs（6.0%）；细胞计数结果与之一致，Mesencult-EVs使细胞数增加49.9%。UCM对照组中，Mesencult-UCM与Nourish-UCM的促增殖与代谢活性均高于对应EV制剂，OptiMEM-UCM与EV Collect-UCM无活性。

3.8 EV与未条件化培养基的抗氧化与成血管潜力

抗氧化实验中，仅OptiMEM-EVs显著降低H₂O₂诱导的ROS水平，Nourish-EVs与Mesencult-EVs反而促进ROS产生。成血管实验中，EV Collect-EVs、OptiMEM-EVs与Nourish-EVs显著增加管形成参数（节段数、节点数、总长度），Mesencult-EVs无显著活性；所有UCM对照组均无成血管作用。

讨论与结论部分指出，本研究首次通过匹配未条件化培养基对照，明确了收集培养基是EV治疗效应的关键混杂因素。研究发现，富含蛋白与粒子的培养基（如含人血小板裂解物的RoosterNourish-MSC-XF）会通过共分离非EV成分显著干扰EV的功能评价，甚至掩盖EV特异性活性；而无动物源、低蛋白的专用收集培养基（如RoosterCollect-EV与OptiMEM）可获得更高纯度的EV，且其生物活性无法被培养基本底解释。研究人员强调，EV的有效治疗剂量具有培养基依赖性，过高浓度的EV（尤其是源于脂质丰富培养基者）可能因诱导细胞膜应激或内体饱和而丧失疗效甚至产生促氧化副作用。该研究确立了“稳定细胞源+专用收集培养基+全流程培养基对照”的标准化框架，为临床级MSC-EV产品的质量一致性控制提供了可操作的规范，其方法论可推广至其他类型EV的生产与评价。