《Journal of Extracellular Vesicles》：Targeted Delivery of GLUT1 Inhibitor via Macrophage Nanovesicles for Pulmonary Arterial Hypertension Therapy
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肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension，PAH）是一种致死性心肺疾病，其病理特征为炎症驱动的血管重构，目前尚缺乏针对促炎M1巨噬细胞糖酵解代谢重编程的精准干预策略。本研究构建了巨噬细胞膜伪装纳米囊泡Mac@WZB117，负载
肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension，PAH）是一种致死性心肺疾病，其病理特征为炎症驱动的血管重构，目前尚缺乏针对促炎M1巨噬细胞糖酵解代谢重编程的精准干预策略。本研究构建了巨噬细胞膜伪装纳米囊泡Mac@WZB117，负载GLUT1抑制剂WZB117，特异性靶向M1巨噬细胞用于PAH治疗。在野百合碱（Monocrotaline，MCT）及SU5416联合缺氧诱导的小鼠PAH模型中，Mac@WZB117可有效靶向肺血管病变部位，显著逆转动脉增厚与胶原沉积。分子分析显示，该体系可下调M1巨噬细胞中GLUT1表达，并促进其从M1向M2表型极化。此外，Mac@WZB117干预可通过抑制糖酵解、脂质代谢及转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）信号通路重塑免疫代谢谱系。空间转录组学分析证实，高活性M1巨噬细胞在病变区域的空间分布发生重组。综上，Mac@WZB117可将WZB117精准递送至M1巨噬细胞，抑制其促炎与代谢功能，重塑免疫微环境并逆转血管结构改变，为PAH及其他免疫代谢性疾病提供了潜在治疗策略。
研究背景与意义
肺动脉高压（PAH）是一种以进行性肺血管重构和血管阻力持续升高为特征的心肺疾病，最终导致右心室负荷过重与心力衰竭。尽管现有药物治疗以血管扩张与抗凝为主，但无法逆转已形成的结构性病变，患者长期生存率未获显著改善。近年研究证实，免疫-血管轴在PAH发病中起关键作用，其中促炎M1巨噬细胞的浸润与异常极化通过分泌细胞因子及旁分泌调控平滑肌细胞增殖，驱动血管炎症与重构。免疫代谢学研究表明，M1巨噬细胞活化高度依赖有氧糖酵解（Warburg效应），其速率受葡萄糖转运蛋白1（Glucose Transporter 1，GLUT1）限制，抑制GLUT1可显著减轻炎症反应与纤维化。然而，小分子GLUT1抑制剂WZB117因缺乏肺组织选择性，易产生脱靶毒性，限制了临床转化。为此，研究人员开发巨噬细胞膜伪装纳米囊泡Mac@WZB117，旨在实现PAH微环境中糖酵解依赖性M1巨噬细胞的精准靶向，阻断糖酵解通量并诱导M1向M2表型重编程，为逆转肺血管重构提供新范式。
关键技术方法
研究采用SU5416联合缺氧及MCT诱导的两种小鼠PAH模型，动物实验遵循ARRIVE 2.0标准并获得伦理批准。研究人员构建巨噬细胞膜伪装聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）纳米囊泡，通过理化表征验证其粒径、电位及药物释放特性。体外建立脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）/干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）诱导的M1巨噬细胞模型，结合共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）、流式细胞术（Fluorescence-Activated Cell Sorting，FACS）及Seahorse能量代谢分析评估细胞摄取与糖酵解功能。通过Transwell非接触共培养体系，研究巨噬细胞对肺血管平滑肌细胞（Human Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells，HPASMCs）增殖、迁移及表型转化的旁分泌调控。体内外机制解析整合单细胞RNA测序（Single-Cell RNA Sequencing，scRNA-seq）、空间转录组学与靶向代谢组学，并结合右心导管血流动力学检测、显微CT（Micro-Computed Tomography，micro-CT）成像及组织病理学分析，全面评价疗效与安全性。
研究结果
3.1 Mac@WZB117纳米囊泡的表征与体外靶向
合成囊泡呈均匀球形，平均直径约164 nm，多分散指数（Polydispersity Index，PDI）为0.18，表面电位为-22.6 mV，具备良好胶体稳定性。该体系在模拟炎症酸性环境（pH 6.5）及活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）条件下表现出显著的刺激响应释药行为，且在M1巨噬细胞内吞效率较游离药物及非伪装囊泡提升3.2倍。
3.2 Mac@WZB117显著降低M1巨噬细胞糖酵解活性
Seahorse分析显示，Mac@WZB117处理使M1巨噬细胞基础糖酵解率、最大糖酵解能力与糖酵解储备分别下降，整体细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate，ECAR）在24小时内降低48.1%。葡萄糖荧光探针2-NBDG检测表明，细胞内葡萄糖摄取量减少35.6%，乳酸分泌量由2.31 mmol/L降至1.32 mmol/L（降幅42.9%）。分子水平上，GLUT1、己糖激酶2（Hexokinase 2，HK2）及乳酸脱氢酶A（Lactate Dehydrogenase A，LDHA）的mRNA与蛋白表达均显著下调。
3.3 Mac@WZB117促进巨噬细胞从M1向M2表型重编程
流式细胞术结果显示，Mac@WZB117处理使CD86+M1细胞比例由82.3%降至38.7%，CD206+M2细胞比例由12.5%升至44.6%。qPCR与免疫荧光证实，M1标志物诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）表达下降61.8%，M2标志物精氨酸酶1（Arginase 1，Arg1）表达上调近2.9倍，提示该体系可多维调控巨噬细胞免疫命运。
3.4 巨噬细胞分泌谱显著改变与免疫激活增强
ELISA检测显示，促炎因子肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）与白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）分泌分别减少55.2%与61.8%，抗炎因子IL-10与TGF-β水平分别上升43.9%与39.7%，分泌谱由促炎型向修复型转变。
3.5 干预后巨噬细胞对平滑肌细胞增殖的抑制作用增强
EdU掺入实验表明，Mac@WZB117处理的巨噬细胞可使共培养的HPASMCs增殖率由67.2%降至31.4%（降幅53.3%），细胞周期分析显示G1期细胞比例由52.7%增至71.2%，提示平滑肌细胞发生G1期阻滞。
3.6 平滑肌细胞迁移能力显著受限
划痕实验显示，干预组24小时创面愈合面积由63.8%降至24.5%（降幅61.6%），细胞平均迁移速率由0.28 μm/min降至0.11 μm/min，表明巨噬细胞旁分泌功能可抑制平滑肌细胞迁移。
3.7 平滑肌细胞合成标志物下调与去分化
qPCR与Western blot结果显示，合成表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）与转凝蛋白（Transgelin，SM22α）的mRNA表达分别降低62.3%与51.9%，蛋白水平分别下降58.2%与47.5%，提示平滑肌细胞向收缩功能态转化。
3.8 TGF-β1与PDGF-BB通路表达显著抑制
Western blot分析显示，Mac@WZB117处理使HPASMCs中TGF-β1蛋白表达降低54.8%，磷酸化Smad2与Smad3水平分别下降46.1%与49.7%；血小板衍生生长因子-BB（Platelet-Derived Growth Factor-BB，PDGF-BB）及其受体PDGFR-β表达分别减少57.2%与44.5%，表明病理性信号通路被阻断。
3.9 Mac@WZB117增强肺组织富集并减少肝脾清除
活体成像显示，Mac@WZB117组肺组织荧光强度达（3.26±0.41）×107光子/秒，分别是游离药物组与非伪装囊泡组的3.5倍与2.8倍；肝脏与脾脏荧光强度分别降低42.7%与37.9%，有效规避网状内皮系统（Reticuloendothelial System，RES）清除。
3.10 Mac@WZB117显著改善右心压力指标
右心导管检测显示，干预组右心室收缩压（Right Ventricular Systolic Pressure，RVSP）由43.2 mmHg降至27.4 mmHg（降幅36.5%），平均肺动脉压（Mean Pulmonary Arterial Pressure，mPAP）由26.0 mmHg降至16.0 mmHg（降幅38.5%），右心室肥厚指数（Right Ventricular Hypertrophy Index，RVHI）由0.52降至0.27（降幅47.8%）。
3.11 肺血管重构与纤维化显著缓解
H&E染色显示，肺小动脉壁厚度百分比（Wall Thickness Percentage，WT%）由35.1%降至17.6%；Masson染色显示胶原沉积面积由21.4%降至10.9%（降幅49.3%），血管重构与纤维化得到有效抑制。
3.12 巨噬细胞中GLUT1表达下调
免疫组化与免疫荧光显示，病变区GLUT1阳性信号显著减弱，GLUT1与CD86双阳性区域占比由65.4%降至21.3%，皮尔逊相关系数由0.78降至0.32，证实体内靶向抑制M1巨噬细胞糖酵解。
3.13 体内巨噬细胞极化比例校正
流式细胞术显示，肺组织F4/80+CD86+M1细胞比例由47.6%降至18.9%，F4/80+CD206+M2细胞比例由7.3%升至20.8%，极化失衡得到纠正。
3.14 scRNA-seq揭示免疫代谢特征
单细胞测序鉴定出9个细胞亚群，巨噬细胞进一步分为M1样与M2样亚群。Mac@WZB117处理使M2样簇比例升高，M1样簇比例降低，且M1样细胞中糖酵解、脂质代谢、TGF-β通路及炎症基因表达普遍下调。
3.15 空间转录组揭示巨噬细胞空间分布重构
空间转录组显示，PAH组GLUT1（Slc2a1）与CD86双阳性信号在病变血管周围高度富集，干预组显著减少；Smad3、Ⅰ型胶原α1链（Collagen Type I Alpha 1 Chain，Col1a1）及Ldha基因表达下调，局部纤维化与代谢重构网络受抑。
3.16 靶向代谢组学揭示糖酵解通路系统性下调
PCA分析显示两组代谢谱明显分离，乳酸、丙酮酸及柠檬酸等关键代谢物普遍下调，糖酵解/糖异生与三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA Cycle）通路显著富集，系统性抑制免疫细胞糖酵解依赖。
3.17 挽救实验证实糖酵解干预为核心机制
腹腔注射糖酵解底物2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-Glucose，2-DG）或GLUT1激动剂Bay-876可逆转Mac@WZB117诱导的M1向M2极化，RVSP与mPAP回升，血管WT%与α-SMA阳性面积部分恢复，证实疗效依赖于糖酵解抑制。
3.18 Mac@WZB117未引起显著全身毒性
血清生化显示谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）及肌酐（Creatinine，Cr）均在正常范围；H&E染色显示心、肝、肾、肺组织结构完整，病理评分低于1分，安全性良好。
讨论与结论
研究人员指出，既往PAH代谢干预多聚焦于血管内皮与平滑肌细胞，而本研究首次将浸润M1巨噬细胞的糖酵解通路确立为关键干预靶点。Mac@WZB117通过巨噬细胞膜同源靶向克服小分子代谢抑制剂的脱靶毒性，实现肺病变区高效富集与M1细胞特异性摄取。多组学分析表明，该体系通过抑制GLUT1依赖性糖酵解通量，阻断M1巨噬细胞的能量供应，促使其向修复型M2表型转化，并破坏病变区的“促纤维化环路”。空间转录组进一步揭示，高活性M1巨噬细胞从重构小动脉周围向肺泡区离散分布，伴随Col1a1、Tgfb1及Ldha等重塑相关基因下调，重塑免疫微环境的空间拓扑结构。该研究建立的“代谢检查点阻断”策略不同于传统抗纤维化或血管扩张疗法，为难治性PAH提供了新的治疗窗口。研究人员强调，未来需在患者来源组织中验证该机制，并优化载体设计以降低长期免疫原性，推动临床转化。论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。
