《Journal of Extracellular Vesicles》：Current Perspective on Human Milk Derived Vesicles and Their Potential Therapeutic Use: A Scoping Review
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人乳来源细胞外囊泡（Human Milk-derived Extracellular Vesicles, HMEVs）因其在母婴通讯及生物医学应用领域的潜力近期受到广泛关注。研究人员在此提供了一项系统性范围综述，结合交互式图表与汇总表格，系统梳理了当前已发表的
人乳来源细胞外囊泡（Human Milk-derived Extracellular Vesicles, HMEVs）因其在母婴通讯及生物医学应用领域的潜力近期受到广泛关注。研究人员在此提供了一项系统性范围综述，结合交互式图表与汇总表格，系统梳理了当前已发表的HMEVs相关知识体系，重点聚焦治疗相关层面，涵盖分离、表征及临床前模型研究中的共识与分歧。通过对Embase与MEDLINE数据库的检索与系统分层，最终纳入113篇原创研究进行分析。研究凸显的关键议题包括：（1）亟需对储存、处理参数及内毒素水平等基础但关键的环节开展更系统的研究与记录；（2）HMEVs的浓度、组成乃至潜在的生物活性会随分娩时的胎龄、泌乳阶段及母体背景发生变化，需在研究中予以考量以（3）明确相关的供体筛选标准。针对临床转化，（4）作用机制与相关安全性参数的界定仍显不足，而这正是定义关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）的必要前提。最后，（5）可用于评估治疗效力的验证性疾病模型的匮乏，构成了HMEVs研究的特殊挑战，因为相关治疗策略本质上聚焦于婴儿生理特征，而这类生理过程难以在啮齿类动物模型中复现。
1 引言
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由活细胞主动分泌的、尺寸通常在纳米至微米级的脂质双分子层包裹颗粒。该脂质双层不仅能展示多种大分子，还可包裹分子组分并保护其免受降解。EVs凭借高稳定性、小尺寸及固有的特异性分子互作功能，成为理想的运输与细胞通讯载体；它们可跨越生物屏障递送货物，并远程影响受体细胞与组织的命运与功能。由于所有生物体细胞均可产生EVs，其可从血液、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊液或乳汁等多种体液中分离获得。其中，乳汁EVs因被证实可在胃酸与高酶活性环境中保护其携带的货物（如miRNAs或mRNAs）、具有口服生物利用度，并参与哺乳动物的多种生理过程而日益受到关注。近年来，人乳EVs（HMEVs）因其免疫调节效应及治疗炎症性与儿科疾病的潜力成为研究热点。过去数年，阐明HMEVs多样分子特征、生物活性及其与供体母亲体质病理生理关联的证据迅速积累，使得对该领域现状进行系统性概述的需求愈发迫切。本研究对现有HMEVs文献及其潜在生物医学应用进行了全面系统的分析，重点关注儿科疾病治疗，并依据《细胞外囊泡研究最小信息量》（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles, MISEV）指南，评估了EV分离技术、样品中EV及其他组分确认方法以及表征技术的当前应用范围。最后，研究人员批判性地讨论了将HMEV候选药物推向临床测试所面临的遗留问题与前景，例如开发适用于人类儿科胃肠道疾病的临床前模型的需求。
2 方法
本研究遵循O'Reilly等人提出的框架，并遵守PRISMA-ScR（系统综述与荟萃分析扩展版范围综述首选报告项目）报告指南，该指南包含22个条目（20项必需，2项可选），旨在提升范围综述的报告质量与系统结构，确保方法与结果的全面透明记录。研究人员通过Ovid平台检索Embase与MEDLINE数据库，采用关键词、主题词及数据库特定语法的组合进行检索。此外，还检索了ClinicalTrials.gov、国际临床试验注册平台（ICTRP）、临床试验信息系统（CTIS）及欧盟药品监管当局临床试验平台（EudraCT），使用关键词“细胞外囊泡”和“外泌体”，并采用与期刊文献相同的纳入排除标准进行筛选。使用基于网络的软件Systematic Review Accelerator去除重复文献。随后通过Covidence在线软件对标题、摘要及全文进行筛选，在纳入最终叙述性综合前，手动筛查已发表文献与临床试验列表以去除潜在重复，并排除所有不符合预设纳入标准的文献。同时排除任何不含原始数据或未经过同行评议的论文（如预印本、致编辑信函、综述文章、社论等）。此外，未真正聚焦人乳EVs、未报告其特征和/或实验性生物活性研究的参考文献，以及关注非人类乳汁或其他非EV纳米颗粒的文章也被排除。文献筛选与分层的PRISMA流程图展示了从提取到最终纳入的分析流程。
3 结果
检索共获得1825条记录（截至2025年5月27日），其中453条被自动识别为重复。三位独立评审员对剩余919篇文章的标题、摘要和全文进行评估后，手动移除了701篇不含原始数据或未同行评议的文章。剩余的219篇研究文章接受全文审查，进一步排除了未真正聚焦人乳EVs的研究，最终116项研究纳入分析。其中3篇因无法获取全文被排除，最终113篇完整获取的研究用于本次系统综述。值得注意的是，尽管首篇相关研究可追溯至2007年，但在过去4-5年间，HMEVs的研究文献数量显著增加，88/113篇发表于2020年之后。研究人员将研究根据其核心焦点聚类为四个主要主题：EV分离方法、EV分子特征、影响EV理化性质和/或分子组成的供体标准，以及与人乳EVs治疗用途相关的生物活性。虽然总体出版物数量在过去5-7年持续增长，但各焦点领域之间未见明显的重心转移，表明HMEVs的所有方面仍需深入探究。除文献数据库外，临床试验数据库检索仅识别出两项涉及HMEVs的观察性研究，分别针对HMEVs预测新生儿黄疸严重程度的作用，以及特定miRNA（miR-486-5p）对骨骼肌生长调节的影响，两项研究均未完成。
3.1 对MISEV准则的依从性
自国际细胞外囊泡学会成立以来，EV研究领域投入了大量努力以确保EV表征、质量控制与报告的严谨性和标准化。MISEV指南于2014年首次发布，并不断更新完善，最新的MISEV2023首次纳入了关于乳汁EVs的章节。本研究依据MISEV2023指南，从三个主要标准组对所有纳入文章进行了批判性评估：原材料表征与前处理（标准组A）、EV与非EV标志物（标准组B）、EV定量（标准组C）。评估由两位具有乳汁EV研究经验的科学家独立完成，分歧通过共识解决。结果显示，113篇文章中，31篇被评为绿色（完全或大部分符合要求），42篇为浅绿色（基本符合，存在轻微缺陷），39篇为橙色（大部分要求未满足）。总体而言，EV专业期刊上发表的文章MISEV评分普遍高于综合性期刊，且明确引用MISEV指南的研究得分更高。专注于方法学开发的出版物MISEV评分持续较高，而主要调查HMEVs生物活性的研究在EV质量控制严谨性方面整体滞后。具体分析发现，许多研究的主要差距在于EV定量方法的详细描述，以及EV与非EV标志物的全面表征。多数研究仅关注一类EV标志物（主要是四跨膜蛋白CD9>CD63>CD81），缺乏MISEV指南要求的第II类和第III类蛋白表征。
3.2 人乳的采集、前处理与储存
大多数研究从总体健康、不饮酒/不吸烟且无（记录）既往病史的母亲处采集乳汁。仅少数研究聚焦特定供体群体，如妊娠糖尿病、季节性过敏或超重患者。约五分之一的研究使用初乳作为EV分离的起始材料，但初乳样本的采集期定义宽松，从产后1天至1周不等，术语使用（初乳、成熟乳、不同泌乳期乳汁）也存在差异。基于此，研究人员建议将样本分类为：产后7天内为初乳，产后15天内为过渡乳，产后15天及以上为成熟乳。多数研究采用前瞻性采集人乳样本，仅少数明确说明来自人乳库。最常用的采集方法是手动/电动吸奶器，但近半数研究未明确具体采集方法。采集后的乳汁或直接处理，或冷藏/冷冻储存，但储存过程的冷却细节常缺失。EV分离前的乳汁储存多采用-20°C或-80°C，近12个月的文章显示-80°C冷冻正逐渐成为共识。部分研究在冷冻前先将乳汁冷却至4°C，或在冷冻前进行脱脂和去除细胞的前处理步骤。然而，冷冻全乳对后续分离的HMEVs数量和亚群的影响仍需明确定义，巴氏消毒对HMEVs类型、组成和完整性的影响也有待专门研究。
3.3 HMEV分离方法
HMEVs的分离通常涉及去除酪蛋白胶束、免疫球蛋白、乳清蛋白及残留乳脂肪球等大分子成分，同时保留并浓缩囊泡。本综述观察到HMEV分离方法存在巨大异质性。最常用的方法是（差速）超速离心法（Ultracentrifugation, UC）（53/113项研究），其次是沉淀试剂盒（33/113项研究），如ExoQuick-TC、exoEasy Maxi等。7项研究联合使用UC与蔗糖/碘克沙醇梯度，10项研究联合UC与尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），4项研究联合UC、蔗糖/碘克沙醇梯度与SEC。另有2项研究采用纯SEC方法，1项采用抗CD63抗体磁珠的亲和分离法。沉淀试剂盒虽操作简便且效率高，但对EV选择性有限，会共沉淀相似大小的非囊泡组分及聚合物残留，可能影响下游结果。即使在UC方法内部，离心速度、温度、时间及步骤组合也存在显著差异，且部分研究仅以rpm而非相对离心力（×g）报告条件，导致难以精确复现实验条件并与他者数据衔接。此外，有两项研究使用了商业化的COSMO Bio公司生产的HMEVs，但该产品同样缺乏符合MISEV准则的详细表征。
3.4 HMEV理化特性与分子组成
共有35篇文章主要聚焦于HMEVs的理化性质或组成表征。其中6篇仅报道理化参数，10篇附加了RNA谱分析，5篇为蛋白质组谱分析，4篇为脂质含量分析，3篇为糖基化模式/人乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides, HMOs）分析。大多数研究（18/35）单独使用UC或与蔗糖/碘克沙醇梯度离心、SEC联用分离囊泡，仅少数使用沉淀法或亲和法。HMEVs的平均尺寸测定主要采用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA），其中Nanosight仪器最为常用（61/76项研究）。形态学表征主要通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）进行。所有研究中，HMEV平均尺寸范围为41至293.9 nm，不同研究间即使使用相同分离方法、乳汁类型和尺寸测定方法也存在巨大变异性。EV产量（以初始材料mL计的颗粒数）的报告尤为缺乏，部分研究仅报告总蛋白产量。蛋白浓度主要采用BCA法测定，但多数文章未提供其与起始体积的关系，且极少同时报告颗粒浓度，因此无法评估文献间的蛋白产量和蛋白质/颗粒比率变异性。HMEV蛋白标志物表征多依赖Western blotting。RNA是目前研究最深入的HMEV货物类型，11/36项研究聚焦于此，且除个别研究涉及lncRNAs或tRNA衍生RNA外，其余均集中于miRNAs。仅有少数文章探索了HMEVs的糖蛋白谱和脂质含量，HMOs与糖基化谱的研究仍处于起步阶段。一个关键未解决问题是，如何结合分离程序对HMEVs（亚）群及共纯化物种的偏倚，解读囊泡功能与其组成之间的相关性，并确证目标货物真正归属于囊泡。纯UC法和沉淀试剂盒通常共纯化大量非囊泡组分，使得难以明确地将货物和功能归因于囊泡本身。
3.5 储存条件的影响
目前仅有的两项系统性研究探讨了储存条件和前处理步骤对人乳EV回收率和/或特征的影响。两项研究均表明，原料乳和分离囊泡的储存条件都会显著影响HMEVs的回收率、产量、质量和组成，进而可能影响其生物活性。因此，需要更广泛系统地研究不同储存和处理条件对HMEV回收率、特性和活性的影响。人乳与牛乳的总体组成大体可比，仅在总蛋白（尤其是酪蛋白）和钙含量较低，寡糖和免疫球蛋白含量较高，这为HMEV领域从更先进的牛乳EV领域进行知识转移提供了可能。
3.6 影响人乳EV特征的供体参数
共有22项研究专门聚焦供体间差异和/或特定供体参数对HMEVs组成、水平和理化性质的影响。这些研究绝大多数集中在miRNA含量上。母亲的心理健康状况（如孕期压力）和身体健康状况（如超重、肥胖、代谢性疾病、哮喘、过敏、病毒感染）均与分离的HMEV样本中miRNA谱的改变显著相关。此外，泌乳阶段也被证明会影响HMEVs的颗粒浓度和miRNA分布。早产似乎会显著降低HMEVs中与DNA损伤反应相关的RNA表达。初步数据显示，环境污染物暴露、母亲生活方式及空气污染物等环境因素也可能影响HMEV的蛋白质组谱。综上，现有数据表明人乳EV的蛋白质组和miRNA谱可能随初乳向成熟乳的转变及泌乳阶段而变化，并可能因个体母体健康状况而异。未来需超越单一的miRNA研究，结合蛋白质组学、脂质组学、代谢组学和聚糖谱分析，更全面地阐明供体参数如何影响人乳EV的组成与生物活性，环境因素、母体营养和生活方式的潜在影响也亟待揭示。
3.7 人乳EVs的生物活性及疾病模型测试
在50篇调查HMEVs生物活性的文章中，28篇将其作为潜在治疗药物在临床前疾病模型中进行了研究。这些研究使用的EVs来源多样，主要从初乳到成熟乳，分离方法以超速离心为主。值得注意的是，13篇文章聚焦于HMEVs在坏死性小肠结肠炎模型中的治疗应用。多项研究还探讨了HMEVs预防或治疗婴幼儿典型感染（如巨细胞病毒、轮状病毒）或妊娠期并发症（如寨卡病毒）的潜力。分析显示，EVs主要用于体外研究，仅少数进行了临床前体内研究，且均为啮齿类动物模型（C57BL/6和BALB/c小鼠或Sprague Dawley大鼠）。大多数相关研究在细胞应激模型中考察了HMEVs的保护特性，使用商业化细胞系或原代组织来源的干细胞/类器官。在细胞模型中，HMEVs主要在共处理和/或后处理的治疗范式下被探索；在体内研究中，给药常与疾病诱导同时进行，难以区分预防和治疗效果。目前，HMEVs在细胞和体内模型中的剂量报告不一致且模糊，多数研究以蛋白质微克或毫克数而非颗粒数来指定剂量，这因共纯化非囊泡蛋白的可变性而存在问题。此外，选择合适的对照以支持HMEVs生物活性的主张仍存在需求，需使用EV耗竭的人乳样品等对照来明确区分HMEVs与非囊泡成分（如乳铁蛋白、HMOs）的治疗活性。
4 讨论
本范围综述通过对Embase和OVID MEDLINE数据库的检索，从最初记录的1825篇文章中筛选出116篇原创研究，最终113篇纳入分析。鉴于EV领域对最低报告和质量控制标准依从性的重要性，分析包含了对报告方法细节和数据的深入评估。深度分析揭示了乳汁EV制备、表征和报告的方法学参数在不同研究间存在显著差异，没有任何两组使用完全相同的方法。这使得协调现有发表结果变得复杂，凸显了遵循MISEV等国际共识指南进行标准化记录和报告的必要性。这一需求在处理人源EV的领域尤为关键，因为供体间差异、泌乳阶段变化等因素增加了复杂性。令人瞩目的是，仅70/113篇文章详细说明了供体参数。MISEV指南的发布、定期更新和持续倡导已开始对人乳EV研究领域产生积极影响，但也预示着早期文献与近期及未来研究之间存在鸿沟，新数据与早期开创性研究的关联将愈发困难。ISEV推出的EV-TRACK报告存储库旨在提供EV研究的透明概览，但本综述纳入的研究中仅15篇登记于该数据库，表明人乳EV领域迫切需要改进报告标准并利用国际存储库。总之，基础层面的不一致，如报告不全、HMEV浓度和产量规格缺失、储存和处理方法学不明，使得对现有数据的全面比较和整体解释复杂化。尽管如此，仍显现出若干新兴议题：HMEV浓度、组成和生物活性可能随母体遗传背景、健康状况、分娩胎龄、泌乳阶段及环境因素发生显著变化；当前数据多聚焦于单一层面，亟需更整体的研究。尤其需要注意的是，许多生物体液中的游离miRNAs主要与EVs无关，因此在得出HMEVs功能依赖于miRNA的结论时，必须提供确凿证据证明miRNAs确实封装于HMEVs内并能功能性转移至受体细胞，避免对缺乏此类证据的数据进行过度解读。
