MsRH53参与油菜素内酯的生物合成，并能正向调节苜蓿的耐盐性

《Plant Science》：MsRH53 is involved in brassinolide biosynthesis and positively regulates the salt tolerance in alfalfa

　　

侯玉卓|徐明志|周青英|袁峰|严建平|刘彦荣|张万军

中国农业大学草地科学与技术学院，北京100193

摘要

基因转化是产生新的耐盐紫花苜蓿（Medicago sativa L.）种质的重要方法，以适应日益严重的土壤盐碱化问题。本研究发现，在盐胁迫下，紫花苜蓿的DEAD-box解旋酶基因MsRH53的表达显著增强。我们推测MsRH53可能在紫花苜蓿的耐盐性中起重要作用。通过基因转化技术，获得了过表达MsRH53的转基因植株。在盐胁迫条件下，与野生型（WT）植株相比，这些转基因植株表现出更强的耐盐性、较低的活性氧（ROS）积累、减少的膜脂质过氧化（MDA含量）以及增强的过氧化物酶（POD）活性。盐处理前后对WT和OE植株进行转录组分析后发现，差异表达基因（DEGs）主要富集在油菜素内酯（BR）生物合成和信号传导途径中。盐处理前后，转基因植株中的BR含量显著高于野生型植株。外源施用BR也提高了紫花苜蓿的耐盐性。综上所述，我们的研究结果表明MsRH53的过表达影响了BR的生物合成并增强了紫花苜蓿的耐盐性，为培育耐盐紫花苜蓿品种提供了新的分子工具。

引言

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作为全球最重要的优质豆科牧草之一，因其高蛋白含量和固氮能力而在畜牧业和土壤改良中发挥着不可替代的作用（Shi等人，2017年）。然而，随着全球气候变化的加剧和灌溉农业的扩展，土壤盐碱化已成为阻碍紫花苜蓿生产的主要环境压力因素之一（Hasanuzzaman和Fujita，2022年）。众所周知，植物通过多种机制应对盐胁迫，包括增加Na?的外排和液泡隔离以降低离子毒性（Yang等人，2005年；Zhu，2003年），积累脯氨酸、可溶性糖和多元醇以维持细胞水分平衡（Bohnert和Jensen，1996年；Wang等人，2015年），以及激活抗氧化酶系统和非酶类抗氧化剂以清除活性氧（ROS）（Gill和Tuteja，2010年）。通过转基因过表达相关基因，已证明这些基因能够提高紫花苜蓿的耐盐性，例如MsSPL12（Lin等人，2024年）、MsNHX（Yang等人，2005年）和MsP5CS（Min等人，2023年）。然而，仍需鉴定耐盐性的关键基因，并揭示其分子机制，以便培育新的耐盐紫花苜蓿种质。

DEAD-box RNA解旋酶（RH）属于RNA解旋酶超家族2（SF2）的最大分支之一（Rao等人，2024年）。RH蛋白家族通常包含九个保守基序，这些基序负责ATP结合和水解、RNA结合以及双链RNA解旋（Cordin等人，2006年）。在植物中，RH广泛分布于不同的细胞区室中，参与从转录后RNA处理到核糖体组装、RNA输出、翻译调控和RNA降解等多个关键过程（Ali，2021年；De Bortoli等人，2021年）。最近的研究表明，RH在多种植物中通过维持离子平衡和调节抗氧化酶活性来增强ROS清除能力，从而在应对胁迫中发挥作用，例如拟南芥（De Bortoli等人，2021年；Yuan等人，2024年）、水稻（Nawaz和Kang，2019年）和番茄（Pandey等人，2019年；Zhu等人，2015年）。此外，在玉米和甘蓝中，ZmRH20和GmRH8通过调节mRNA代谢和信号传导来提高植物对高盐、干旱或低温胁迫的耐受性（Wang等人，2022年；Wen等人，2024年）。还有一些研究表明，RH参与ABA生物合成和信号传导以及非生物胁迫的调节（Baek等人，2018年）。例如，RH8通过抑制其相互作用伙伴PP2CA磷酸酶的活性来正向调节干旱胁迫和ABA信号传导（Baek等人，2018年）。rh3-4突变体在萌发后早期生长期间ABA水平较低，对非生物胁迫更敏感（Lee等人，2013年）。这些研究表明，RH通过复杂的机制在植物应对多种非生物胁迫中发挥关键作用。然而，DEAD-box解旋酶在调节紫花苜蓿耐盐性中的功能和机制仍有待揭示。

油菜素内酯（BRs）是一类重要的植物甾醇激素，在调节植物生长发育和环境胁迫响应中起着关键作用。有研究表明，提高StDWARF（StDWF4）的表达——这是一种关键的BR生物合成酶基因——显著增强了马铃薯的耐盐性（Zhou等人，2018年）。多项研究显示，BRs通过激活BZR1转录因子来上调抗氧化酶基因的表达，从而降低ROS水平，提高植物的非生物胁迫耐受性（Yang等人，2019年）。在拟南芥中，过表达BRASSINAZOLE RESISTANT 1（BZR1）和BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1（BES1）转录因子SlBZR1增强了BR响应和耐盐性（Jia等人，2021年）。此外，BRs还通过调节NADPH氧化酶活性来响应胁迫，从而调节ROS信号传导（Bhatt等人，2019年）。RNA解旋酶（RHs）和油菜素内酯（BRs）均被证明可以独立缓解各种非生物胁迫，包括干旱和极端温度（Ahammed等人，2020年；Pandey等人，2020年）。然而，它们在更广泛的胁迫信号网络中的潜在相互作用仍大部分未被探索。最近的研究表明，RHs可能整合到经典的植物激素途径中，例如在干旱期间微调ABA响应（Huang等人，2016年）。同时，模型植物的研究开始揭示核心BR信号成分与RNA代谢因子之间的功能交集，例如RNA结合蛋白CSP2最近被发现可以在低温胁迫下调节BZR1的翻译效率（Yang等人，2026年）。尽管有这些新的发现，但目前尚无直接实验证据表明DEAD-box RHs和BR生物合成途径如何在盐胁迫条件下共同调节ROS清除。因此，解决这一调控交集对于更好地理解豆科植物的多层次胁迫适应机制至关重要。

在本研究中，我们发现编码DEAD-box RNA解旋酶的MsRH53基因对紫花苜蓿的盐胁迫有响应。过表达MsRH53通过增强ROS清除能力提高了紫花苜蓿的耐盐性。结合转录组分析，发现MsRH53的过表达影响了BR的生物合成。外源施用也证明了BR在调节紫花苜蓿耐盐性中的积极作用。本研究为紫花苜蓿和其他豆科植物的耐盐性遗传改良提供了新的分子工具和理论基础。

章节摘录

系统发育树的构建

从紫花苜蓿‘XinJiangDaYe’的参考基因组数据库中提取了MsRH53基因家族的氨基酸序列（Fang等人，2023年）。使用NCBI的BlastP工具，以MsRH53为查询词，获得了拟南芥、Medicago truncatula、玉米、甘蓝、小麦和油菜的RH氨基酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/）（表S2）。

DNA/RNA提取和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析

使用CTAB方法从紫花苜蓿叶片中提取基因组DNA（Liu等人，2022年）。总RNA的提取方法...

MsRH53基因在紫花苜蓿中的功能表征

通过保留DEAD-box结构域克隆并验证了MsRH53基因，其与参考基因MsRH53（基因ID：Ms.gene038106）的相似度为98.65%（图S1）。系统发育分析显示MsRH53与豆科植物中的同源基因（如Medicago truncatula和大豆）具有密切的进化关系（图1A）。检测表达模式的结果表明MsRH53在紫花苜蓿的所有测试组织中都有表达，尤其是在侧芽（CY）中表达量最高（图1B）。

讨论

盐胁迫是限制紫花苜蓿生长和产量的主要非生物胁迫因素（Hasanuzzaman和Fujita，2022年；Munns和Gilliham，2015年）。通过增强抗氧化酶的活性和调节相关基因来减少ROS积累已被证实是紫花苜蓿耐盐性的关键策略之一（Lin等人，2024年）。基于盐处理前后紫花苜蓿的RNA测序分析，发现DEAD box RNA解旋酶基因MsRH53的表达显著增强...

结论

本研究证实MsRH53能够正向调节紫花苜蓿的耐盐性。在盐胁迫条件下，转基因植株具有更强的ROS清除能力。转录组和BR含量分析表明，MsRH53调节了BR的生物合成/信号传导，并在其转基因植株中维持了较高的BR水平。外源施用EBR增强了紫花苜蓿的耐盐性并促进了ROS的清除。总体而言，我们的研究为培育耐盐紫花苜蓿提供了新的分子工具（图7）。

资助

本研究得到了呼和浩特市重大科技项目（编号：2024-JBGS-N-2-1）、兵团科技计划（2024AB020）以及国家草业技术创新中心（准备中）（CCPTZX2024GJ02-3，CCPTZX2024GH02）的支持。

CRediT作者贡献声明

徐明志：正式分析。侯玉卓：方法学研究、实验设计、数据分析、概念构建。张万军：资金筹集。袁峰：正式分析。周青英：正式分析。刘彦荣：资金筹集。严建平：数据管理。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢编辑、审稿人和实验室成员对本文提出的宝贵建议。

作者声明他们没有利益冲突。