《Synthetic and Systems Biotechnology》：Hfq-dependent artificial regulatory small RNAs for targeted gene expression control in the nitrogen-fixing Pseudomonas stutzeri A1501
编辑推荐：
人工反式编码小RNA（artificial trans-encoded small RNAs，atsRNAs）通过碱基配对抑制靶mRNA翻译，已成为重构细胞工厂与遗传回路的重要工具。目前，理性设计的atsRNAs多基于大肠杆菌天然反式作用小RNA，采用Hfq结
人工反式编码小RNA（artificial trans-encoded small RNAs，atsRNAs）通过碱基配对抑制靶mRNA翻译，已成为重构细胞工厂与遗传回路的重要工具。目前，理性设计的atsRNAs多基于大肠杆菌天然反式作用小RNA，采用Hfq结合结构与Rho非依赖终止子作为骨架。然而，由于大肠杆菌与其他细菌的Hfq蛋白结构存在差异，异源sRNA骨架可能削弱atsRNAs的抑制效率，凸显在不同细菌中筛选天然sRNA骨架以开发功能性合成sRNA的必要性。根际关联细菌施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501是固氮研究的模式菌株，但其转录后调控平台仍较匮乏。本研究基于该菌天然Hfq依赖型sRNA CrcZ骨架，开发了atsRNA平台。研究人员设计了两种靶向固氮主调控复合体编码基因nifLA操纵子的atsRNAs，证实其在P. stutzeri A1501中可有效抑制nifLA基因的转录后水平表达。进一步研究表明，靶mRNA的5′非翻译区（5′ untranslated region，5′ UTR）及五个Hfq结合位点是基于CrcZ骨架设计atsRNAs的最佳特征。所确立的CrcZ sRNA骨架合成sRNA高效设计原则，将促进假单胞菌属合成基因网络的理性设计与工程优化。
施氏假单胞菌A1501是重要的联合固氮菌，在农业氮素供应中具有重要应用潜力。当前，基于大肠杆菌开发的Hfq依赖型人工反式编码小RNA（atsRNA）已在代谢工程中广泛应用，但由于不同物种Hfq蛋白在序列与结构上存在差异，异源sRNA骨架在非模式菌中的抑制效率受限。此外，P. stutzeri A1501缺乏高效的转录后调控工具，限制了其复杂固氮网络的精准重构。为此，研究人员以该菌天然存在的Hfq依赖型sRNA CrcZ为骨架，构建了适用于假单胞菌属的atsRNA表达平台，旨在实现靶向基因的精细调控。该研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：通过生物信息学筛选获得P. stutzeri A1501内源性CrcZ sRNA，并验证其Hfq结合特性；基于CrcZ骨架设计靶向nifLA操纵子的atsRNA变体，构建广宿主表达质粒；利用微尺度热泳（microscale thermophoresis，MST）测定sRNA与靶mRNA及Hfq蛋白的结合亲和力；通过qRT-PCR分析基因转录水平，β-半乳糖苷酶报告系统检测翻译活性，乙炔还原法测定固氮酶活性，以及利福平追踪实验评估sRNA稳定性。
研究结果如下：
3.1 选择P. stutzeri A1501内源性反式作用sRNA作为合成sRNA骨架
研究人员筛选出CrcZ sRNA，其含有Rho非依赖终止子poly-U尾及五个CA富集基序的Hfq结合位点，符合合成sRNA骨架的关键设计标准。
3.2 靶向nifLA操纵子的合成sRNA设计与表征
设计两种atsRNA：AnsR-U5靶向nifLA mRNA的5′ UTR（从预测核糖体结合位点到AUG密码子），AnsR-O5靶向编码区（AUG及其下游17个碱基）。两者均在固氮条件下被诱导表达，且不影响宿主生长。
3.3 合成sRNA有效抑制P. stutzeri A1501固氮能力
AnsR-U5与AnsR-O5分别将固氮酶活性降至野生型的22%与更高水平，并显著下调nifLA及固氮结构基因nifHDK的表达。回补nifA基因可恢复固氮酶活性至野生型水平，证实抑制作用源于nifA表达下调。
3.4 合成sRNA在转录后水平抑制nif基因表达
MST实验显示AnsR-U5与nifLA mRNA的解离常数（Kd）为13±1 nM，结合亲和力高于AnsR-O5（Kd=29±1 nM）。碱基配对突变显著降低结合能力与抑制效率，β-半乳糖苷酶报告实验进一步证实AnsR-U5通过结合5′ UTR抑制翻译起始。
3.5 合成sRNA沉默效率与Hfq结合位点数量呈正相关
随着Hfq结合位点从5个减少至0个，atsRNA的半衰期从22.5分钟缩短至11分钟，在Δhfq突变体中进一步降至5-6分钟。MST结果显示，结合位点越多，与Hfq的亲和力越强（Kd从16±0.33 nM降至8±0.42 nM），固氮酶抑制效率越高。
讨论部分指出，与传统基因敲除相比，atsRNA无需染色体修饰即可实现基因敲低，更适合必需基因的功能研究与代谢通路精细调控。CrcZ骨架因具有多个Hfq结合位点且主要通过结合Hfq发挥调控作用，可减少脱靶效应。本研究证实，靶向5′ UTR并结合五个Hfq结合位点的CrcZ骨架设计策略，可为假单胞菌属提供高效、特异的转录后调控工具。
研究结论表明，基于假单胞菌保守的CrcZ sRNA骨架开发的atsRNA平台，能够有效抑制P. stutzeri A1501中nifLA操纵子的翻译。最优沉默效果需要靶mRNA 5′ UTR的可及性及CrcZ骨架中嵌入的五个Hfq结合位点。这一发现为跨假单胞菌属的靶向基因抑制提供了通用策略。
