《Synthetic and Systems Biotechnology》：Development of an efficient genome editing system using recombinase-mediated cassette exchange in E. coli Nissle 1917 for large gene cluster integration and heterologous astaxanthin production
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大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917, EcN）是合成生物学领域极具潜力的底盘菌株，但其遗传操作效率低下限制了应用。本研究通过电穿孔条件优化与重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediated c
大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917, EcN）是合成生物学领域极具潜力的底盘菌株，但其遗传操作效率低下限制了应用。本研究通过电穿孔条件优化与重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediated cassette exchange, RMCE）技术，建立了EcN的高效遗传操作系统。系统筛选显示，采用SB培养基培养并以无菌去离子水作为洗涤缓冲液可显著提升EcN的电穿孔效率，进一步优化电穿孔参数后增强了RMCE效率。研究人员构建了重组菌株EcN-lox，通过将loxP-hyg-lox5171盒式元件插入EcN基因组（替换产大肠菌素基因clbB），作为位点特异性整合外源基因的稳定着陆垫。与直接电穿孔相比，该RMCE系统在整合大片段外源DNA时表现出显著优势，成功介导了17 kb与29 kb基因簇片段的整合，而野生型EcN无法通过直接电穿孔稳定维持大质粒。最终，研究人员应用该系统将10 kb的人工虾青素生物合成操纵子整合至EcN中，实现了虾青素的异源生产。摇瓶培养条件下，重组菌株于LB培养基37 °C培养24 h可获得最高产量（0.627 mg g?1DCW）。综上，本研究优化的电穿孔方案与RMCE介导的基因组整合系统为EcN的基因工程改造提供了有力工具，将推动其在高价值天然产物异源合成及其他合成生物学领域的应用。
《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的该研究针对益生菌底盘大肠杆菌Nissle 1917（EcN）遗传操作效率低、大片段整合困难的瓶颈展开。EcN因安全性高、肠道定植能力强，是活体生物治疗与代谢产物的理想递送载体，但其外膜组成、限制修饰系统等固有特性导致传统电穿孔与同源重组效率远低于模式大肠杆菌，尤其难以实现超过10 kb的外源基因簇稳定整合，制约了其复杂途径的工程化应用。研究人员通过系统优化电穿孔体系，结合Cre-loxP重组系统开发了高效的重组酶介导的盒式交换（RMCE）平台，并在EcN中实现了大片段基因簇的稳定整合与高价值产物虾青素的异源合成，为EcN的合成生物学应用提供了关键技术支撑。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：系统筛选电穿孔制备的培养基与洗涤缓冲液以提升转化效率；利用λ-Red重组系统构建携带正交lox位点的基因组着陆垫菌株EcN-lox，替换毒力基因clbB；构建携带不同大小盐霉素基因簇片段及虾青素合成操纵子的RMCE供体质粒；通过阿拉伯糖诱导Cre重组酶表达，实现外源基因在基因组着陆垫的位点特异性交换；采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-TQMS）定量发酵产物虾青素。
研究结果如下：
3.1 通过筛选培养基与洗涤缓冲液提升EcN电穿孔效率
研究人员首先评估了不同洗涤缓冲液的影响，发现无菌去离子水因无离子且低渗，能最大程度促进电击成孔，效率是SH缓冲液的14倍。随后比较6种培养基，SB培养基因兼具高营养与低单价离子浓度，电穿孔效率最高，是LB培养基的1.94倍；同时确定室温制备感受态细胞的效率优于4 °C制备。
3.2 基因组安装loxP-hyg-lox5171盒式元件作为RMCE整合着陆垫
研究人员选用正交的野生型loxP与突变型lox5171位点，通过λ-Red重组将携带潮霉素抗性基因的loxP-hyg-lox5171盒式元件插入EcN基因组，替换产基因毒性物质大肠菌素的clbB基因，获得重组菌株EcN-lox，既消除了毒力因子，又为外源基因提供了位点特异性的稳定整合位点。
3.3 通过RMCE实现大片段外源DNA在EcN基因组的整合
研究人员构建了携带17 kb、29 kb、42 kb盐霉素基因簇片段的RMCE供体质粒。结果显示17 kb片段可高效整合，29 kb片段整合效率下降16.3倍，42 kb片段无法整合。通过优化电穿孔电压与感受态制备温度，确定4 °C制备感受态、1350 V电击可使29 kb片段的整合效率提升30倍。对照实验表明，野生型EcN仅能维持17 kb质粒的瞬时存在，更大片段则完全无法导入，凸显了RMCE在大片段整合中的独特优势。
3.4 通过RMCE整合10 kb人工操纵子在EcN中实现虾青素异源生产
研究人员将来自泛菌属、贪噬菌属的虾青素合成基因crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ、crtW及大肠杆菌自身的idi基因构建为10 kb人工操纵子，经RMCE整合至EcN-lox基因组获得EcN-asta菌株。发酵结果显示，30 °C培养60 h时LB培养基产量最高（0.05 mg g?1DCW）；优化为37 °C培养24 h后，产量提升至0.627 mg g?1DCW，增幅达11.8倍，证实该菌株具备高效合成虾青素的潜力。
讨论与结论部分指出，与传统重组技术相比，该RMCE系统突破了EcN中大片段（>10 kb）整合的效率限制，避免了转座系统的随机插入风险与CRISPR相关转座酶（CAST）的载量局限。研究成功建立的EcN高效遗传操作系统，不仅实现了大基因簇的稳定整合，更首次在EcN中完成了虾青素的全细胞生物合成，为EcN作为活体生物治疗底盘及高价值天然产物生产平台奠定了技术基础，推动了其在合成生物学与工业生物技术领域的应用拓展。
