针对膜蛋白的双miRNA激活DNA四边形传感器，用于精准识别肿瘤细胞

《Talanta》：Membrane protein-targeted and dual-miRNAs-activated DNA quadrilateral sensor for accurate tumor cell identification

赵春辉|赖振志|何娇|李亚倩|陈峰|陈春燕|龚航|蔡长群

摘要

肿瘤细胞的识别对癌症诊断至关重要，目前主要关注细胞表面蛋白。在这项研究中，我们证明了通过整合细胞表面蛋白和双重miRNA来设计传感器可以实现高特异性。该DNA四边形传感器是通过组装一个适配体以及两个具有多个互补链的miRNA互补序列构建的。该适配体能够特异性识别肿瘤细胞的膜蛋白。这两个miRNA互补序列被用来构建一个AND逻辑信号输出，以响应细胞内的双重miRNA。只有当膜蛋白和双重miRNA同时存在时，传感器才能在细胞中高特异性地工作。通过对表达不同膜蛋白和双重miRNA的各种类型癌细胞进行成像，我们的传感器展示了出色的目标肿瘤细胞成像分析能力。

引言

尽管我们在化疗、放疗和外科手术方面取得了进展，癌症仍然是全球主要的死亡原因之一[1]。识别癌细胞是癌症诊断的基础，这可以显著改善癌症患者的临床结果。目前，多色免疫荧光是细胞识别的金标准[2]。然而，它需要多个抗体染色步骤，并且不适合动态疾病监测。最近在细胞成像方面的进展以及包括细胞表面蛋白、细胞内RNA和DNA在内的更多生物标志物的发现，促进了细胞识别方法的发展[[3], [4], [5], [6]]。已经有多种基于细胞表面蛋白的方法被证明可以识别癌细胞，包括双重分裂适配体[7]、pH诱导的HCR系统[8]、多价DNA纳米爬行者[9]、多适配体基DNA逻辑器件[10]、DNA多任务处理器[11]和多模态DNA纳米结构条形码[12]。大多数报道的DNA系统都集中在细胞表面蛋白的识别上。细胞表面蛋白的差异表达为可靠地识别细胞类型提供了巨大机会[13]。细胞表面蛋白表现出高度复杂的表达谱，某些生物标志物在健康细胞和病变细胞中都存在[14,15]，这使得仅通过单一细胞表面蛋白准确识别癌细胞变得具有挑战性。因此，对多个标志物进行逻辑分析为精确识别肿瘤细胞提供了重要机会。

miRNA是内源性产生的小分子非编码单链RNA，已被证明通过调节目标信使RNA的切割来促进肿瘤的发生和发展[[16], [17], [18]]。miRNA的异常表达因不同类型的癌细胞而异[19,20]。因此，miRNA是癌症诊断中有前景的生物标志物。已经有多种方法被应用于活细胞中的miRNA检测[[21], [22], [23]]。然而，癌症是一种多因素疾病，通常涉及多种miRNA[24,25]。这些miRNA可以靶向一个或多个mRNA，因此仅识别其中一种可能不够[26,27]。显然，同时识别多种miRNA对于癌症诊断更为可靠。同时，细胞表面蛋白作为识别癌细胞的第一步，在肿瘤细胞的识别中具有重要意义。据我们所知，尚未有利用膜蛋白和双重miRNA构建逻辑门的实现。因此，我们旨在整合双重miRNA和细胞表面蛋白，以构建一个用于准确识别癌细胞的系统。

编程DNA组装使得功能DNA纳米结构的合理设计成为可能[28,29]。我们试图开发一种针对膜蛋白并受双重miRNA激活的DNA传感器，以实现准确的癌细胞识别。由于miRNA-21、miRNA-10b和黏蛋白1（MUC1）是预测患者生存率和个性化癌症治疗的知名癌症生物标志物，因此选择miRNA-21、miRNA-10b和MUC1作为癌细胞识别的分子[30,31]。我们利用MUC1适配体来实现对癌细胞表面过表达的MUC1的特异性识别[32]。为了实现双重miRNA（miRNA-21和miRNA-10b）的逻辑信号输出，我们设计了一个触发结构（命名为S1），该结构被miRNA-21和miRNA-10b的互补序列（分别为C21和C10b）阻断。MUC1适配体、C21和C10b与五个互补链（分别命名为S1–S5）组装成一个DNA四边形传感器（图1）。该传感器在目标细胞上的工作依赖于两个连续事件：适配体-膜蛋白识别介导的细胞内化，随后是miRNA-21和miRNA-10b的AND逻辑输入。结合细胞表面蛋白和细胞内的双重miRNA，DNA四边形传感器能够特异性地成像目标肿瘤细胞。这种基于蛋白质和miRNA的多模态策略提高了细胞分析的性能，从而推动了精准医学的发展。

章节片段

DNA四边形传感器的工作原理

在构建传感器之前，我们设计了DNA序列。为了识别miRNA-21，我们设计了miRNA-21的互补序列（命名为C21）、S1链的一部分和S2链（图S1A），并通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）研究了miRNA-21的组装和链位移反应。如图S1B所示，单链S2和miRNA-21分别在第1道和第2道泳道上显示出最高的迁移率。

结论

总之，我们提出了使用细胞表面蛋白和细胞内双重miRNA进行高度特异性肿瘤细胞识别的概念。为了验证这一概念，我们开发了一种针对膜蛋白并受双重miRNA激活的DNA四边形传感器，该传感器由三个功能DNA链组成，包括MUC1蛋白适配体、miRNA-21和具有多个互补链的miRNA-10b互补序列。该传感器在响应miRNA-21时产生AND逻辑信号输出。

CRediT作者贡献声明

赵春辉：数据整理、形式分析、资金获取、研究、方法学、撰写——初稿。赖振志：数据整理、研究。何娇：数据整理、方法学。李亚倩：方法学。陈峰：资金获取、研究、项目管理、撰写——审阅与编辑。陈春燕：方法学、资源。龚航：方法学、资源。蔡长群：撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了湖南化工职业技术学院的博士研究启动基金（HY26BS004）、湖南省自然科学基金（2025JJ60075）和国家自然科学基金（22404139）的支持。