《Communications Biology》：Molecular regulators of regeneration and strategies for overcoming genotype-dependent recalcitrance in wheat (Triticum aestivum)
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高效的小麦遗传转化仍受限于许多优良栽培品种中强烈的基因型依赖性和较低的再生能力。本综述总结了转化方法的最新进展，包括农杆菌介导递送、基因枪法、纳米颗粒系统和病毒载体，重点介绍了BBM/WUS、GRF4-GIF1、WOX基因和TaLAX1等再生促进因子的鉴定与功
高效的小麦遗传转化仍受限于许多优良栽培品种中强烈的基因型依赖性和较低的再生能力。本综述总结了转化方法的最新进展，包括农杆菌介导递送、基因枪法、纳米颗粒系统和病毒载体，重点介绍了BBM/WUS、GRF4-GIF1、WOX基因和TaLAX1等再生促进因子的鉴定与功能表征进展。此外，多组学研究揭示了体细胞核重编程过程中的转录与染色质动态变化，但基因型依赖性再生的遗传基础仍不明确。本综述提出，结合逐步表型分析、基因组资源利用和系统遗传学方法，有望为实现小麦基因型非依赖性转化提供可行路径。
引言
小麦是全球最重要的主粮作物之一，为人类提供主要的能量和蛋白质来源。在气候变化与自然资源日益受限的背景下，维持并提升小麦产量对全球粮食安全至关重要。与玉米和水稻类似，小麦育种已从传统选择与推动生产力快速提升的绿色革命，发展到能够更精准培育高产、稳产、抗病、优质品种的分子设计育种阶段。随着基因编辑、大数据与人工智能（AI）的发展，未来将生物技术与智能设计相结合的育种策略，有望支撑更具针对性的改良，加速培育适应市场需求的新品种。植物再生能力不仅是重要的生物学过程，也是现代农业生物技术的基石。高效的植物再生是现代育种与基因编辑应用的必要条件，但在许多作物中再生仍是主要瓶颈。尽管通过大量筛选已在少数物种中建立了相对稳定的遗传转化体系，但其效率与广泛适用性仍有限。已有研究表明激素在植物再生中起核心作用，生长素与细胞分裂素（CK）的动态平衡及空间分布构成了决定再生组织向根或芽发育的调控“黄金法则”。此外，损伤也是再生的重要触发因素，不仅能作为物理刺激，还可激活钙信号、活性氧（ROS）动态变化及相关转录调控因子，如WINDs、ERF115和PLT3/5/7，进而启动细胞重编程。除这些因子外，还鉴定出多个可驱动细胞命运转变并促进再生的重编程基因，随着机制研究的深入，对这些因子的策略性利用有望克服作物再生与遗传转化中长期存在的挑战。本综述整合了当前关于遗传转化与再生机制的认知，以阐明植物遗传转化中基因型依赖性的成因，并探索应对这一挑战的潜在策略，同时为开发高效、稳定且无外源基因的转化工具与方法提供实践参考，助力小麦功能基因组学发展与生物技术育种加速。
主要作物遗传转化方法
1928年，F. Griffith首次在肺炎链球菌中描述了“转化”现象，证明可遗传性状可通过特定生物物质在不同菌株间转移。1944年，O.T. Avery团队通过严谨的肺炎链球菌转化实验，确定DNA为“转化因子”，奠定了现代分子生物学的基础。20世纪70年代起，一系列技术突破实现了DNA的精确操作。1972年，Paul Berg利用SV40病毒与λ噬菌体构建了首个重组DNA分子，被誉为重组DNA技术的里程碑。次年，Boyer与Cohen利用质粒实现了外源基因在大肠杆菌中的稳定导入，为基因克隆奠定了基础。在植物科学领域，早期Ledoux与Hess尝试将外源DNA导入种子或花粉，迈出了植物遗传转化的第一步。1983年，首例转基因烟草诞生，标志着植物转基因时代的开启。进入21世纪，基因编辑技术的发展进一步推动了植物遗传转化向更高精度发展，目标实现靶向且可预测的基因组修饰。
农杆菌介导转化是目前植物基因工程中最有效且应用最广泛的方法之一，支持基因功能研究与作物改良。根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，可通过类接合机制将Ti质粒上的T-DNA转移至植物细胞，且天然T-DNA区域可被任意目标序列替换而不影响转移过程。1997年首次报道了农杆菌介导的小麦转化成功案例。此后，通过对菌株类型、共培养温度、酚类诱导物乙酰丁香酮（AS）、抗氧化剂二硫苏糖醇（DTT）、胚发育阶段及愈伤组织预培养条件的优化，常规转化效率已提升至3%–8%。2009年，Risacher等开发了原位注射法，减少了无菌操作步骤，但对技术要求较高，限制了推广。日本烟草的PureIntro?/PureUpgrade?专利系统在晚近时期实现了较高转化效率，但因依赖专有载体与专项培训，在学术界的普及受限。随着转化效率的提升，基于CRISPR/Cas9的小麦基因编辑也取得了显著进展。尽管如此，农杆菌介导转化在许多优良栽培品种中仍面临困难。
对于难以通过农杆菌转化的作物与基因型，基因枪法是广泛使用的替代方案。值得注意的是，小麦的基因枪转化早于农杆菌法。近期进展进一步拓展了其应用，如Luo等通过将内含子优化与温度优化的Cas12a变体递送至茎尖分生组织（SAM），大幅提升了小麦中Cas12a介导的基因编辑效率。此外，优化的基因枪方案已在18个中国主栽小麦品种中实现稳定转化，扬麦19转化率达13.22%，科农199达11.51%。近年来，纳米颗粒介导转化成为新兴策略，利用碳纳米管、介孔二氧化硅纳米颗粒或DNA纳米结构等纳米级载体将遗传物质转运至植物细胞，其表面性质可被改造以最小程度损伤细胞壁穿透细胞，且不受宿主特异性或毒力诱导要求的限制。该系统特别适合递送CRISPR/Cas核糖核蛋白复合物，实现Cas核酸酶的瞬时表达而不发生DNA整合，这对获得无外源基因的编辑植株具有重要优势，尽管在小麦等主要禾谷类作物中仍处于早期发展阶段。
与此同时，病毒载体递送系统也被开发用于实现无需体外再生的稳定遗传转化。Li等建立了基于大麦条纹花叶病毒的sgRNA递送系统（BSMV-sg），在Cas9转基因小麦中实现了可遗传的基因编辑，不同品种后代突变体频率为12.9%–100%，且53.8%–100%的植株不含病毒。近期，Qiao等利用负链RNA病毒大麦黄条点病毒（BYSMV）共递送Cas9与sgRNA，借助小麦分蘖特性与移动RNA元件将编辑活性转移至腋芽分生组织，实现了生殖系传递，解决了病毒载体易产生仅体细胞编辑的局限，实现了真正的无外源基因、无组织培养且基因型非依赖的稳定转化。然而，病毒载体仍存在固有机制限制，多数植物病毒以游离体形式独立复制，不整合入宿主基因组，导致遗传不稳定与长期表达受限；病毒感染还会触发强烈的植物防御反应，尤其是RNA沉默，降低病毒RNA持久性并限制持续表达；此外，超感染排斥效应限制了二次递送，且病毒载体的装载容量低于农杆菌系统，同时需谨慎评估生物安全性问题。
小麦关键再生促进因子
高效植物再生是大多数作物遗传转化成功的主要决定因素之一，但其调控分子机制，尤其在小麦等单子叶植物中仍未完全阐明。近年来，一类被称为形态发生调节因子（MRs）的基因被证明可有效提升植物再生能力并降低转化过程中的基因型依赖性。
核心再生调控因子及其应用
在玉米中，组成型过表达BABY BOOM（BBM）与WUSCHEL2（WUS2）可显著提升顽固自交系的转化效率。由于持续表达这些强发育调控因子可能导致严重生长缺陷，研究者开发了诱导型表达系统，利用干旱响应rab17启动子驱动CRE重组酶表达，可在再生后精准切除BBM/WUS2表达盒，形成“即用即弃”策略，减少非预期发育缺陷。BBM与WUS的协同作用不仅限于原生质体或幼胚，优化后的表达载体还支持以叶片为外植体，在玉米与高粱中高效获得转基因与基因编辑植株，该外植体灵活性已在包括大麦与水稻在内的9种单子叶植物中得到验证，显著降低了转化技术门槛。
GRF-GIF嵌合体系统与精准切除策略
在小麦中，GRF4-GIF1融合蛋白（GRF-GIF嵌合体）的表达可显著提升转化效率，包括顽固冬小麦品种Skyfall与Valoris。为避免对生长发育的负面影响，研究者开发了“使用-删除”系统，将GRF4-GIF1表达盒两侧引入loxP位点与热诱导CRE重组酶（HvHsp17）。芽再生后，短暂热处理（40℃过夜）可诱导CRE表达，实现GRF4-GIF1片段的高效精准切除。在品种Kronos中，该一步切除法的切除效率可达73%，成功切除表达盒的植株异常分蘖减少且育性恢复，这种“发射后不管”策略为获得不含残留形态发生调节因子的转基因或基因编辑小麦提供了有效途径。
WOX家族与其他关键内源因子
WUSCHEL相关同源盒（WOX）基因家族成员在多种植物的再生中发挥核心作用。在小麦中，过表达TaWOX5可显著提升多个难转化品种的转化效率。另一重要调控因子是异源碱性螺旋-环-螺旋转录因子TaLAX1，包含A、B、D三个同源拷贝。过表达TaLAX1-A可将顽固品种矮抗58与济麦22的再生频率从2.22%–3.83%提升至31.34%–35.62%。机制研究表明，TaLAX1可直接结合TaGIF1-A、TaARF3-D与TaIPT1-A的启动子，从而激活TaGRF4-TaGIF1模块，增强生长素响应并促进细胞分裂素合成。值得注意的是，TaLAX1的同源基因（玉米ZmBA1与大豆GmLAX1）同样可增强相应物种的再生能力，表明该基因在单双子叶植物中具有保守的再生促进功能。近期研究结合拟南芥叶肉原生质体再生的单细胞转录组数据与玉米组织特异性表达谱，克隆到13个候选基因，其中AP2转录因子ZmHSCF1在转化感受态自交系LH244的过表达株系中显著改善愈伤组织质量与诱导效率，展示了分生组织调控因子在促进组织再生中的潜力。
多组学驱动的再生网络分析与新因子鉴定
为在分子层面解析再生通路，研究者对小麦品种Fielder幼胚早期再生过程开展了RNA-seq、ATAC-seq与CUT&Tag等多组学分析，追踪转录与染色质动态变化。结果显示，细胞命运转变过程中生长素驱动的转录重编程与染色质可及性、组蛋白修饰（包括抑制性H3K27me3与激活性H3K4me3标记）的动态变化相协调。研究构建了包含446个核心转录因子的小麦再生转录调控网络，富集于AP2、ERF与DOF家族。与拟南芥的比较分析揭示了DOF转录因子在物种间存在特异的DNA结合特征。功能验证证实，TaDOF5.6、TaDOF3.4与近期鉴定的TaDOF4.7可显著提升多个小麦基因型的转化效率，包括顽固品系济麦22与科农199，为克服基因型依赖性提供了新工具。
新型非转基因诱导策略：REF1肽
应用再生因子的一大挑战是避免其对植物生长发育的非预期影响。近期番茄研究中鉴定到一种植物激发肽REF1，作为一种非转基因再生增强因子具有广阔前景。REF1是一种独立于系统素的局部损伤信号，可高亲和力结合其受体PORK1（含LRR胞外域、跨膜域与胞质激酶域的受体样激酶），激活下游AP2/ERF家族转录因子SlWIND1，形成正反馈回路（REF1-PORK1 → SlWIND1 → REF1前体基因），促进损伤诱导的愈伤形成与器官再生。外源施用合成REF1肽可显著提升多个顽固作物的再生与转化表现，包括野生番茄PI126944转化效率提升12倍、大豆东农50基因编辑效率提升5倍、小麦济麦22再生效率提升8倍，提供了一种强有力的非转基因方法以增强作物遗传转化。
再生的基因型依赖性
评价作物遗传转化系统的核心标准是其跨遗传背景的稳定性。但在小麦中，仅有少数品种表现出高再生与转化效率。日本烟草开发的PureWheat技术虽广泛应用，但仍存在强烈基因型依赖性，仅Fielder、科农199与科农9204等少数品种能维持稳定的高转化效率，多数优良品种仍难以再生或转化。相比之下，大豆与高粱转化研究通过优化外植体选择与诱导方法，已在十余个基因型中成功实现再生。在高粱中，酚类物质积累差异被认为是影响基因型特异性再生的因素之一，但遗传性状与再生表现之间的更广泛关联及其分子基础仍不清楚。主要限制在于缺乏在生理与分子层面系统比较不同基因型与外植体再生敏感性的研究。
为应对这一挑战，需首先明确PureWheat转化流程的关键步骤：外植体选择、农杆菌侵染、愈伤诱导、愈伤增殖、芽原基诱导、芽伸长与生根。目前尚未有研究通过连锁作图或全基因组关联分析（GWAS）等正向遗传学方法揭示各步骤中基因型变异的遗传基础。主要障碍在于难以建立定量的再生能力衡量指标，因多数小麦基因型再生率极低或无再生，导致表型分布极度偏斜。尽管如此，多组学研究已显著加深了对植物再生的理解，包括体细胞核重编程的起源、转录级联、激素调控与表观遗传重塑。
小麦研究中，Liu等对高转化品种Fielder幼胚早期再生过程生成了详细的多组学数据集，通过RNA-seq、ATAC-seq与CUT&Tag分析，表征了再生早期的转录与染色质动态，发现时间顺序的基因表达模式（包括胚胎身份基因下调、细胞命运转变与器官起始）与生长素信号紧密协调，并与染色质可及性变化、H3K27me3抑制及H3K4me3激活相偶联。研究还构建了包含1766个转录因子与31272个调控节点的转录调控网络（TRN），鉴定出446个核心转录因子，其中包括40个已知拟南芥再生基因的同源基因。有趣的是，小麦再生早期激活的是DOF家族转录因子，而拟南芥再生主要依赖LBD家族调控因子，凸显了植物再生的保守性与物种特异性。然而，小麦中强基因型依赖性再生的遗传基础，尤其是多数优良品种的顽固性，仍未被系统解析。
为此，本研究提出整合逐步表型分析、基因组资源与系统遗传学的综合策略。第一步是在多样小麦品种中建立精细的再生表型分析流程，不仅关注最终再生效率，还需定量追踪关键发育转换节点：愈伤诱导时间、愈伤增殖速率、愈伤褐化率、芽诱导时间、芽伸长速率、芽再生频率、植株再生频率与生根时间。为提高表型分析的准确度与通量，可采用RUBY等可视化标记系统进行非破坏性实时监测，RUBY可产生肉眼可见的甜菜红素，若置于再生相关启动子（如TaWOX5或TaLAX1）控制下，可实现特定再生阶段转录激活的时空追踪，为各发育步骤的动态与效率提供可视化定量信息。将该标记辅助表型策略应用于多样小麦种质群体，可精准识别各基因型再生失败或成功的发育节点。结合现代小麦基因组资源，该高通量表型策略为解析再生的遗传基础提供了新机遇。小麦泛基因组可捕获不同品种间的存在-缺失变异与结构变异，有助于揭示影响关键再生基因或调控元件的变异，例如TaLAX1或TaDOF5.6同源基因启动子区差异可能贡献再生能力变异。构建具有多样再生能力的核心种质泛基因组，可帮助在基因组水平鉴定再生相关的结构变异。整合逐步表型数据与泛基因组支持的GWAS分析，可精确定位调控特定再生阶段的位点，最终超越对“再生能力”的笼统测量，获得机制层面的认知。此外，在特定再生阶段对高再生与顽固基因型进行比较多组学分析，可识别差异转录因子活性、染色质状态与激素响应。基于整合的基因组、表型与多组学数据训练的机器学习模型，最终可用于预测再生潜力，指导更具转化能力的小麦品种选育或工程改造。多组学数据与AI及机器学习框架的整合，最终有望实现对不同品种或种质再生能力的评估，并为改良提供预测性策略。综上，精细表型分析、泛基因组资源与系统遗传学的结合，为解析小麦基因型依赖性再生的机制提供了全面策略，将支持关键调控基因与通路的鉴定，加速这一重要作物功能基因组学与精准育种的转化效率提升。
通过调控因子与分步流程优化提升小麦再生并开发高效转化方法
基于PureWheat的转化流程包含多个关键步骤：农杆菌侵染、愈伤诱导、愈伤增殖、芽原基起始、芽伸长与生根。近期进展主要集中在改善愈伤诱导、增殖与芽原基起始环节，而农杆菌介导的T-DNA转移与稳定基因组整合的分子机制仍不清楚，现有证据表明这些过程也可能受基因型强烈影响，但具体调控位点与细胞决定因子尚未被鉴定。
从植物-微生物互作角度看，不同品种外植体细胞壁组成与表面性质的差异可能影响农杆菌附着；细胞内信号转导与内吞作用的变异可能影响T-DNA-Vir蛋白复合物的摄取，这是转化效率的关键决定因素。其他作物的研究表明，植物-微生物互作存在显著的种间与组织特异性差异，凸显外植体选择对转化成功的重要性。辣椒研究中，通过系统筛选农杆菌敏感性（通过病毒诱导基因沉默效率评估）与再生能力（通过侧芽形成评估），从最初低效的矮化品种MiniPep转向响应基因型PC69，成功建立了高效的辣椒转化体系，强调了在实施下游技术优化前选择适宜植物材料的重要性。
小麦中可能也存在类似情况，不同品种在农杆菌敏感性、外植体响应性与组织重编程潜力方面的变异可能显著影响转化结果。深入理解农杆菌与幼胚组织间的早期细胞互作，将有助于鉴定适宜的外植体类型与更具转化能力的基因型，为改进转化体系奠定坚实基础。
在增强后续再生步骤方面也取得了实质性进展，特别是小麦及其他物种的愈伤诱导、增殖与芽原基起始环节。在拟南芥中，联合过表达PLT与WOX家族基因，或共表达WUS与BBM，已实现无激素再生。在玉米中，类似策略大幅提升了转化效率。在小麦中，共递送GRF4-GIF1或TaLAX1作为辅助构建体，可显著增加愈伤形成与芽再生，尤其在顽固品种中效果显著。这些发现表明，再生促进因子可帮助克服基因型限制并大幅提升转化表现。
重要的是，再生调控因子仅在特定的发育窗口发挥最佳效果。例如，PLT与WOX家族基因主要促进早期细胞重编程与多能性获得，而WUS/BBM组合主要在后期刺激芽原基形成。这种时间特异性提示，对辅助因子进行时序性、阶段特异性的表达可能优于常导致多效性缺陷的组成型表达。利用阶段特异性启动子在相关再生阶段激活辅助因子，是一种在不加剧负面发育效应的前提下提高转化效率的有前景策略，这在当前小麦基因型依赖性再生的遗传基础认知有限的背景下尤为重要。
克服再生调控因子应用障碍并开发高效清洁转化工具
尽管形态发生调节因子作为植物转化辅助因子具有巨大潜力，但若干挑战阻碍了其实用化进程。最突出的问题是再生调控因子基因在再生植株中的持续表达，若无适当控制会干扰正常生长发育。
应对策略之一是优化启动子选择。环境或化学诱导型启动子可在重编程期间实现再生调控因子的可控、阶段特异性激活，并在后期发育中关闭。该方法的成效高度依赖于启动子强度、特异性、诱导动力学以及与组织培养条件的兼容性。此外，通过大规模转录组数据集鉴定出的在再生期间高表达而在成熟组织中沉默的启动子，也可提供无需外部诱导的精确时空控制。互补策略是设计自我消除型辅助构建体，利用可诱导Cre-loxP系统实现再生后调控基因靶切除。近期研究中，该切除介导策略实现了GRF4-GIF1的精准时空控制，将其表达限制在愈伤组织与幼胚中，有效消除了非预期多效性。其他策略还包括去除辅助载体中的选择标记，或将选择压力转移至促进辅助构建体的移除，以及设计可选择清除在目标发育阶段后仍保留调控基因的细胞表达盒。
为获得真正无外源基因的植株，非整合递送系统具有独特优势。基因枪法、纳米颗粒介导递送与病毒表达策略可瞬时表达再生因子而不将外源DNA整合入宿主基因组，这些方法尤其适用于生产经基因编辑但无外源基因的植株，这对监管审批与公众接受度日益重要。
总结与展望
高效的小麦遗传转化是支撑现代分子育种的基础技术。基因与蛋白质工程、基因组编辑及AI驱动的育种设计均依赖于可靠、高效且广泛适用于多样品种的转化体系。因此，小麦转化研究具有重要的科学与实用价值。
本综述总结了近期进展并指出限制小麦及其他顽固作物转化的关键未解挑战，主要包括对小麦再生调控分子机制的理解不完整、基因型依赖性再生能力的遗传基础不明，以及再生促进因子的最优利用策略欠缺。基于现有认知，协同应用形态发生调节因子与转化辅助构建体以支持目的基因的高效整合，是改进小麦转化方法极具前景的路径。展望未来，靶向基因工程有望实现对转化流程各步骤的精细优化，包括外植体与农杆菌菌株的精细化组合，以及部署特定辅助因子（如促进愈伤诱导的启动子、促进增殖的调控因子与支持芽分化的因子），并各自在最有效发育阶段激活。基于当前研究进展，我们认为作物（如小麦）的遗传转化过程可拆解为离散步骤，通过正向遗传学（如GWAS）与反向遗传学（如多组学分析）针对各步骤相关性状进行研究，可鉴定调控各阶段的核心因子。这些因子可进一步用于阶段特异性调控，并通过共接种、阶段特异性启动子时序控制及多基因叠加等组合策略，最终优化整体转化流程并在较短时间内显著提升效率。转化技术的持续改进将拓展基因组编辑与生物技术育种的应用范围，更高的转化效率可直接支持更复杂的多重基因编辑。随着转化障碍的消除，研究者可追求更宏大的工程目标，从协同通路修饰到染色体水平的基因组设计。同时，由优化启动子、编码序列与调控元件构建的模块化遗传工具包将愈发实用，实现向多样小麦品种的快速可靠递送。AI可用于分析大规模组学数据，加速植物再生关键调控元件的发现，例如利用机器学习预测筛选特异性启动子，并结合基因编辑技术实现对再生因子表达的精准调控。整合这些策略可预测再生因子的组合效应并分析多样小麦品种的基因型特异性响应，从而指导优化转化策略的设计。该模块化框架可显著加速基础遗传学发现向实际育种应用的转化。此外，转化技术与合成生物学、自动化及AI驱动设计的融合，有望进一步拓展小麦改良的可能性。最终，稳健、基因型非依赖的小麦转化系统的建立，将为基因组创新与应用育种的衔接提供关键桥梁，为应对未来全球粮食安全与可持续农业的挑战提供必要工具。
