尼古丁生物合成通过隐蔽性活化糖基化完成

《Nature Communications》：Nicotine biosynthesis is completed by cryptic activating glucosylation

　　

研究人员报道了(S)-尼古丁从烟酸(nicotinic acid)和N-甲基吡咯啉鎓(N-methylpyrrolinium)经四酶立体选择性生物催化级联反应完成的完整途径，其中包含两个参与隐蔽性活化糖基化的葡萄糖加工酶。研究人员还在植物体内重构了该通路，并解析了关键碳-碳键形成还原酶-氧化酶对的底物与产物复合物的高分辨率X射线晶体结构。本研究确立了尼古丁的完整生物合成途径，为调控烟草属(Nicotiana)生物碱生产提供了新的基因靶点，并开辟了吡啶类生物碱的酶促合成路线。

研究背景方面，尼古丁是烟草(Nicotiana tabacum)产生的神经活性生物碱，用于防御植食性昆虫，也是人类使用数千年的成瘾性兴奋剂。尽管其重要性显著，其核心生物合成步骤长期未被阐明。早期标记前体喂养实验推测尼古丁骨架通过类似Mannich反应的机制形成，但关键酶与中间体一直未获验证。烟草及其生物碱在化学生态学、代谢运输、遗传调控及代谢进化研究中具有重要地位，近年来本氏烟草(Nicotiana benthamiana)成为重组生产治疗分子的平台，但尼古丁的存在给下游加工带来挑战。因此，解析尼古丁生物合成途径对基础生物学与应用生物技术均具有重要意义。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：基于烟草基因组与转录组数据的生物合成基因簇挖掘与候选基因筛选；体外多酶一锅法级联反应重构，结合同位素标记底物追踪原子水平转化；X射线晶体学解析关键酶-配体复合物的三维结构；农杆菌浸润瞬时表达在本氏烟草叶片中重构通路并进行代谢产物分析；野生型与突变体植株根系代谢组检测验证中间体与旁路产物。

研究结果部分，首先，研究人员在烟草基因组中发现包含β-葡萄糖苷酶(β-GD1)、还原酶(A622)及转运蛋白(MATE1)的生物合成基因簇，并鉴定到一个UDP-依赖糖基转移酶(UGT1, 系统命名UGT709L18)，其表达模式与已知尼古丁合成基因高度相关。其次，体外重构实验证实四酶级联反应由烟酸和N-甲基吡咯啉鎓生成(S)-尼古丁，各酶功能被重新定义：UGT1为烟酸N-葡萄糖基转移酶(NaGT)，A622为烟酸N-葡萄糖苷还原酶(NaGR)，BBLa为(S)-尼古丁葡萄糖苷合酶(NicGS)，β-GD1为尼古丁葡萄糖苷水解酶(NicGH)。第三，体外底物范围拓展显示该级联可替换不同亲电试剂生成去甲基尼古丁(nornicotine)和安那巴辛(anabasine)等同系生物碱。第四，同位素标记实验表明NaGR将NADPH的氢加至烟酸N-葡萄糖苷C6位，而NicGS特异性移除二氢尼古丁葡萄糖苷C6位的氘，实现立体选择性氢交换。第五，X射线晶体结构显示NaGR与NADP⁺及烟酸N-葡萄糖苷结合，C6距离NADP⁺的C4约3.4 ?；NicGS与FAD及(S)-尼古丁葡萄糖苷结合，C6距离FAD反应性氮约3.2 ?，与同位素实验结果一致。第六，植物体内重构实验中，在本氏烟草叶片共表达全通路基因后，检测到标记的(S)-尼古丁生成；基因敲除(drop-out)实验验证了各酶的功能与立体选择性控制作用。第七，在野生型与突变体植株根系中检测到尼古丁葡萄糖苷、吡啶葡萄糖苷等中间体，NaGR敲除株积累烟酸N-葡萄糖苷，NicGS敲除株则积累吡啶葡萄糖苷与尼古丁葡萄糖苷，与体外结果相符。

讨论部分指出，该研究解决了尼古丁生物合成近两个世纪以来的关键谜题，明确了四酶级联途径。隐蔽性糖基化在此充当活化基团，提高烟酸的还原反应活性，不同于已知的葡萄糖苷储存或保护功能。同源基因功能冗余支持所选代表性酶的普适性。通路跨细胞区室分布（胞质与液泡）不支持其为单一多酶复合物，而是可溶性酶协同作用。NicGS的立体选择性机制可能涉及动态动力学拆分或差向异构化，但具体细节仍需进一步研究。该发现不仅为烟草属碱代谢工程提供了精确靶点，也为手性吡啶类化合物的酶促合成开辟了新途径。

研究结论为：研究人员完成了尼古丁完整生物合成途径的分子与生化解析，揭示了隐蔽性糖基化在天然产物合成中的独特活化作用，为植物代谢工程与生物催化工具开发奠定了重要基础。