CircCDK6通过Wnt/β-连环蛋白信号通路调控肺腺癌干性维持及顺铂耐药

《Cancer Management and Research》：CircCDK6 Regulates Stemness Maintenance and Cisplatin Resistance in Lung Adenocarcinoma via the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway

摘要 本研究旨在探讨环状RNA CDK6（circCDK6）在维持肺腺癌（LUAD）肿瘤干细胞（CSC）特性及介导顺铂耐药中的作用，重点关注Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的参与。研究人员采用实时荧光定量PCR检测多种LUAD细胞系中circCDK6的表达水平，通过质粒介导过表达及小干扰RNA（siRNA）介导敲低进行功能增益与缺失实验，利用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）及集落形成实验评估顺铂敏感性，并使用Wnt通路抑制剂IWR-1探究该通路的作用。此外，通过建立BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型，在体内评估circCDK6敲低对顺铂疗效的影响，并通过苏木精-伊红染色及Ki-67免疫组化分析肿瘤组织变化。结果显示，circCDK6在H1299及H1975细胞中表达显著升高；过表达circCDK6可上调CD133、Oct4及Sox2等干性标志物，增加IC50值并促进集落形成，增强顺铂耐药；反之，沉默circCDK6则显著降低顺铂耐药。蛋白质印迹分析表明，circCDK6通过上调Axin2、β-catenin及c-Myc激活Wnt/β-catenin通路。体内实验中，敲低circCDK6可减小肿瘤体积，增强顺铂抗肿瘤效应，并降低Ki-67表达。研究人员得出结论，circCDK6可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进LUAD的CSC特性及顺铂耐药，提示其有望成为克服LUAD化疗耐药的潜在治疗靶点，但仍需进一步研究验证其作用及临床相关性。

肺腺癌化疗耐药新机制：circCDK6通过Wnt/β-连环蛋白通路调控干性与顺铂耐药的研究解读

肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的亚型，占所有肺癌病例的40%以上。随着全球吸烟模式改变及环境污染加剧，LUAD发病率显著上升，尤其在女性和非吸烟者中更为明显。由于早期常无症状，多数患者确诊时已处于晚期，尽管影像技术与分子标志物改善了早期检测，但筛查策略的实施与可及性仍面临挑战。顺铂是目前LUAD标准化疗药物之一，但随着治疗进展，越来越多的患者出现顺铂耐药，严重影响治疗效果。肿瘤干细胞（CSC）在肿瘤起始、进展及化疗耐药中发挥关键作用，阐明LUAD中CSC相关干性的分子机制，可为克服化疗耐药提供新思路。环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，参与肿瘤发生、进展及化疗耐药，但circCDK6在LUAD中的作用与机制尚未明确。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路是调控细胞增殖、分化及迁移的经典通路，在多种癌症发病及顺铂耐药中具有重要地位。基于此，研究人员开展本研究，旨在明确circCDK6是否通过Wnt/β-catenin通路介导LUAD顺铂耐药，为寻找克服治疗失败的新靶点提供依据。该研究发表于《Cancer Management and Research》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：使用经短串联重复序列（STR）鉴定的四种人LUAD细胞系（A549、H1299、H1975、PC-9），通过质粒转染实现circCDK6过表达，针对circCDK6反向剪接位点设计siRNA进行敲低；采用实时荧光定量PCR检测circCDK6表达，蛋白质印迹分析干性标志物及通路相关蛋白；通过CCK-8实验及集落形成实验评估顺铂敏感性；利用BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型，分组给予阴性对照siRNA、阴性对照联合顺铂、circCDK6 siRNA联合顺铂处理，监测肿瘤生长并计算肿瘤生长抑制率（TGI），通过苏木精-伊红染色及Ki-67免疫组化评估肿瘤组织损伤与增殖活性；结合生物信息学预测circCDK6相关miRNA及Wnt通路靶基因，并分析TCGA-LUAD数据集中CDK6与Wnt通路基因的关联。

研究结果如下：

CircCDK6通过调控干性标志物表达维持LUAD细胞干性

RNase R处理后circCDK6稳定存在而线性mRNA显著降解，证实其环状结构。qRT-PCR显示circCDK6在H1299及H1975细胞中表达高于A549及PC-9细胞。敲低circCDK6显著下调CD133、Oct4及Sox2蛋白表达，过表达则上调这些干性标志物，表明circCDK6可促进LUAD细胞干性维持。

CircCDK6表达与LUAD细胞顺铂敏感性改变相关

CCK-8实验显示，过表达circCDK6的A549细胞IC₅₀从4.263 μM升至10.18 μM；敲低circCDK6的H1299细胞IC₅₀从10.59 μM分别降至2.594 μM及1.622 μM。集落形成实验中，过表达组在不同浓度顺铂下集落数更多，敲低组集落数显著减少且随顺铂浓度升高更明显，证实circCDK6上调降低顺铂敏感性，沉默则增强药物应答。

CircCDK6表达与Wnt/β-catenin信号活性及顺铂反应相关

蛋白质印迹显示，过表达circCDK6显著上调Axin2、β-catenin及c-Myc蛋白水平，降低磷酸化β-catenin（p-β-catenin）及磷酸化GSK3β（p-GSK3β）水平，总GSK3β无变化。CCK-8实验中，过表达组的IC₅₀为13.36 μM，显著高于对照组3.351 μM；加入Wnt通路抑制剂IWR-1后IC₅₀降至5.080 μM，表明circCDK6介导的顺铂耐药可被通路抑制部分逆转。

CircCDK6敲低改善LUAD体内顺铂疗效

体内实验显示，circCDK6 siRNA联合顺铂组肿瘤体积、重量均显著小于对照组。肿瘤生长曲线显示，该组从第3周起生长速率明显降低，第4周平均体积低于300 mm³。TGI计算显示，与阴性对照组相比，阴性对照联合顺铂组TGI为55.57%，而circCDK6 siRNA联合顺铂组相对TGI达81.98%，总TGI为91.99%，证实circCDK6敲低可显著增强顺铂体内抗肿瘤效应。

CircCDK6敲低联合顺铂增强肿瘤组织损伤并降低Ki-67表达

苏木精-伊红染色显示，阴性对照组肿瘤细胞排列密集、核深染，顺铂组部分组织破坏，联合组组织架构紊乱、细胞密度降低。Ki-67免疫组化显示，阴性对照组增殖活性高，顺铂组中度下降，联合组显著降低，半定量分析证实联合组Ki-67阳性细胞百分比最低。

讨论部分指出，本研究首次报道circCDK6可通过激活Wnt/β-catenin通路同时调控LUAD干性与顺铂耐药。既往研究显示circRNA可通过miRNA轴调节化疗耐药，而本研究提示circCDK6可能通过多miRNA汇聚作用于Wnt通路组分发挥作用。TCGA数据分析支持CDK6（作为circCDK6替代指标）与Wnt通路基因正相关。体内外实验均证实靶向circCDK6可增强顺铂疗效，为克服LUAD化疗耐药提供了潜在靶点。研究也存在局限性，如未实验验证circCDK6与miRNA或RNA结合蛋白的相互作用，未评估circCDK6的临床诊断或预后价值，未排除siRNA对线性CDK6的脱靶效应，体内实验缺乏单药组及更全面的分子检测等，需后续研究完善。

结论部分总结：本研究表明circCDK6可能通过Wnt/β-catenin通路促进LUAD的CSC特性及顺铂耐药，抑制该通路可部分逆转这些表型，circCDK6有望成为克服LUAD化疗耐药的潜在治疗靶点，但仍需进一步遗传学与功能实验验证。