《Protein Expression and Purification》：Highly Proliferative Silkworm Cell Line: Development of a New Line for Recombinant Protein Production
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阿布巴卡尔·努拉（Abubakar Nura）| 杰·曼·李（Jae Man Lee）| 正津田（Akitsu Masuda）| 藤本敏明（Toshiaki Fujimoto）| 莫恩（Hiroaki Mon）| 藤（Tsuguru Fuji）| 高桥雅辉（Takahashi M
阿布巴卡尔·努拉（Abubakar Nura）| 杰·曼·李（Jae Man Lee）| 正津田（Akitsu Masuda）| 藤本敏明（Toshiaki Fujimoto）| 莫恩（Hiroaki Mon）| 藤（Tsuguru Fuji）| 高桥雅辉（Takahashi Masateru）| 日坂博宏（Takahiro Kusakabe）| 日野雅人（Masato Hino）
日本福冈市西区本冈744，九州大学生物资源与生物环境科学研究生院昆虫基因组科学实验室
摘要
重组蛋白（如疫苗、抗体和酶）在研究、兽医和医疗应用中发挥着重要作用。昆虫细胞-杆状病毒表达系统被广泛用于重组蛋白的生产，由于家蚕（Bombyx mori）细胞对杆状病毒敏感，因此也可以使用它们。然而，许多家蚕来源的细胞系存在增殖缓慢以及B. mori潜伏病毒（BmLV）持续存在的局限性。为了解决这些问题，我们从B. mori胚胎中建立了一个新的培养细胞系BmMAX7050np，并评估了其生长特性和蛋白质生产能力。BmMAX7050np的增殖速率大约是常用BmN细胞系的两倍，并且其生长速率与Sf9细胞相当。未检测到BmLV的存在。该细胞系既支持贴壁培养也支持悬浮培养，适合大规模蛋白质生产。我们使用了几种细胞内和分泌蛋白作为目标蛋白，以评估在杆状病毒多角体启动子控制下的生产水平。BmMAX7050np和Sf9细胞的蛋白质产量相当。
总体而言，这些发现表明BmMAX7050np是一个有前景的实验室和工业规模蛋白质生产细胞系。
引言
昆虫培养细胞是从昆虫组织（最常见的是胚胎）中提取的细胞群体，在受控的实验室条件下长期维持。它们提供了一个均匀且可重复的系统，可以研究生物过程而无需考虑整个昆虫的复杂性。自从第一个连续昆虫细胞系建立以来，这些细胞系已被广泛用于研究细胞生理学、基因调控、先天免疫反应、蛋白质表达和病毒-宿主相互作用。它们稳定的生长特性、明确的培养要求以及一致的生物学反应使得昆虫细胞系成为基础和应用昆虫研究中的重要实验平台[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。
蛋白质分子（包括疫苗、抗体、激素、细胞因子和治疗性酶）是医学、兽医和研究领域的重要工具。昆虫及其来源的培养细胞系是高效生产重组蛋白的理想宿主。杆状病毒-昆虫表达系统（BEVS）具有多种优势，如高蛋白质产量、能够进行翻译后修饰、低人类病原体污染风险以及多基因共表达的能力[4]、[5]、[6]。除了常用的来自Spodoptera frugiperda和Trichoplusia ni的昆虫细胞系外，来自家蚕Bombyx mori的细胞系也因其对杆状病毒感染的天然敏感性而成为重组蛋白生产的理想平台[7]、[8]。
杆状病毒科（Baculoviridae）包含感染双翅目、膜翅目和鳞翅目昆虫的病毒[9]。其中，Autographa californica多核多角体病毒（AcMNPV）和B. mori多核多角体病毒（BmNPV）被广泛用作昆虫及其培养细胞中高效表达重组蛋白的载体[10]。AcMNPV具有广泛的宿主范围，可感染多种鳞翅目物种；因此，它被广泛用于来自S.frugiperda（Sf9和Sf21）和T.ni（High Five及其他T. ni来源的细胞系）[11]的培养细胞系[11]。然而，许多这些细胞系携带外来病毒，例如Sf细胞中的< />杆状病毒（Sf-RV）和High Five细胞中的Tn细胞系病毒，这些病毒在生物制药生产中是不希望出现的[12]、[13]、[14]。
与AcMNPV不同，BmNPV的宿主范围仅限于B. mori来源的细胞，因此家蚕幼虫或蛹以及家蚕培养细胞被用于重组蛋白的生产。与整个动物表达系统相比，培养细胞系具有蛋白质产量稳定、可扩展性和生物变异减少等优点[15]、[16]。然而，许多已建立的家蚕细胞系存在缺点，包括增殖缓慢、重组蛋白表达评估不足以及B. mori潜伏病毒（BmLV）的持续感染[10]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。尽管之前已经开发出了第一个无BmLV的细胞系（BmVF）[26]，但其缓慢的增殖速率限制了其工业应用性。这些局限性凸显了改进家蚕细胞系的必要性。
在这项研究中，我们开发了一种新的B. mori细胞系BmMAX7050np，该细胞系具有快速增殖、高效的重组蛋白生产能力和无BmLV的特点。这一改进的细胞系有望推动基于家蚕的BEVS在研究和工业中的应用。
章节片段
家蚕品系B. mori p50是一种标准的实验室品系，具有明确的遗传信息，并有可用的参考基因组（RefSeq组装：GCF_030269925.1）[27]。将雌性p50品系与高蛋白产量的近交品系n70[28]进行杂交（图1A）。所得到的F1胚胎被用于建立细胞系。之前在纸上产下的蚕卵用2%甲醛固定，在室温下用盐酸处理1小时
BmMAX7050np细胞系是从p50和n70杂交系的F1胚胎中建立的（图1A），具体方法见材料与方法部分。BmMAX7050np细胞主要为圆形，而其中一部分细胞呈现纺锤形（图1B）。定量细胞大小分析显示，BmMAX7050np细胞的直径比BmN细胞小（图1C）。根据测量结果，BmMAX7050np的平均细胞直径为17.9 ± 3.4 μm，而BmN细胞的平均直径为21.4 ± 4.2 μm
杆状病毒表达系统已经生产出了许多用于人类和兽医的许可疫苗，目前还有许多候选疫苗正在开发中[4]。昆虫宿主细胞是BEVS的重要组成部分，为异源基因的高水平表达提供了平台。基于家蚕的BEVS已被广泛用于表达各种重组蛋白，包括生长因子、免疫球蛋白、细胞因子和疫苗[42]、[43]。
在准备这项工作时，作者使用了Microsoft Copilot来提高语言表达和可读性。使用该服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。
莫恩（Hiroaki Mon）：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究。藤（Tsuguru Fuji）：撰写——审阅与编辑、资源、方法学。高桥雅辉（Takahashi Masateru）：撰写——审阅与编辑、方法学。日坂博宏（Takahiro Kusakabe）：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。日野雅人（Masato Hino）：撰写——初稿撰写、可视化、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念构思。阿布巴卡尔·努拉（Abubakar Nura）：撰写——初稿撰写
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：日野雅人报告称获得了Kakihara科学技术基金会的财务支持。日野雅人拥有待审批的专利（专利申请方为九州大学和国家大学法人）。日坂博宏拥有待审批的专利（专利申请方为九州大学和国家大学法人）。如果还有其他作者，他们声明没有已知的利益冲突
