《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：The mechanical microenvironment and lung stem cell fate
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肺是一个复杂的分支状器官，其发育过程精密且高度协调，可生成数十种不同类型的细胞。目前已有多种方案可在培养条件下将干细胞分化为肺组织细胞，以补充动物实验，用于解析肺发育、稳态维持及损伤应答的基本机制。然而，这些方案普遍存在效率低下且重现性差的问题。为优化现有分化
肺是一个复杂的分支状器官，其发育过程精密且高度协调，可生成数十种不同类型的细胞。目前已有多种方案可在培养条件下将干细胞分化为肺组织细胞，以补充动物实验，用于解析肺发育、稳态维持及损伤应答的基本机制。然而，这些方案普遍存在效率低下且重现性差的问题。为优化现有分化方案，需深入解析胚胎发育过程中肺上皮细胞如何与周围的生化微环境和机械微环境发生相互作用。本综述系统阐述了促进肺祖细胞及成熟肺上皮细胞生长与分化的不同微环境信号，并重点介绍了近期细胞培养模型中应用的机械微环境组分。研究人员提出，通过理解并整合这些微环境信号组合以更好地模拟体内机械生态位，有望提升肺培养模型的效率、重现性及生理准确性。
引言
肺由数十种细胞类型构成，周围分布着多种细胞外基质（ECM）蛋白，并具有区域特异性的力学特性。该器官起源于前肠内胚层（AFE），而AFE又由原肠胚形成后不久产生的定型内胚层（DE）发育而来。AFE的腹侧模式化调控肺域的特化，这一过程可通过转录因子Nkx2-1的表达进行识别。肺芽形成并启动分支后，肺上皮沿近端-远端轴线发生模式化：近端祖细胞产生club细胞、纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞及神经内分泌细胞，定植于肺上气道；远端祖细胞则产生肺泡Ⅰ型（AT1）和Ⅱ型（AT2）细胞，衬覆于肺泡表面。每种祖细胞均定位于独特的微环境中，由邻近基质细胞、细胞外基质及其他物理因素共同构成“机械生态位”。近期转录组学分析显著提升了对肺细胞群体的识别精度，数据显示人肺包含15种上皮细胞类型，较小鼠肺的上皮细胞类型多出7种，凸显了人肺相较于小鼠肺的细胞复杂性。构建能够精准模拟体内生理条件的培养模型，对推进人肺发育、再生及疾病研究至关重要，并可补充啮齿类动物的机制研究结果。基于细胞培养的新方法（NAMs）正逐步能够在减少动物使用的前提下，提供化学品危害与风险评估信息。然而，当前培养模型仍受限于标准化与重现性问题，且细胞分化状态常与体内对应细胞存在差异。本综述总结了近期揭示体内肺细胞命运调控微环境信号的研究进展，探讨如何通过模拟天然机械生态位，提升体外肺干细胞分化的重现性、可扩展性及生物学准确性。
细胞互作的影响
过去十年间，研究人员已建立多种方案，可将人和小鼠多能干细胞（PSCs，包括诱导多能干细胞iPSCs和胚胎干细胞ESCs）直接分化为肺上皮祖细胞及更成熟的上皮谱系。这些方案通常模拟局部微环境中的逐步生化变化，以复现体内肺上皮的发育轨迹：使用高浓度激活素A处理PSCs，模拟原肠胚形成过程中的结节信号，诱导形成DE细胞；随后使用Noggin和SB431542分别抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGFβ）的下游信号，获得AFE细胞；再通过WNT、BMP和成纤维细胞生长因子（FGF）处理诱导AFE腹侧化，产生肺祖细胞；持续给予BMP和FGF则可推动肺祖细胞成熟为近端细胞类型（如club细胞）和远端细胞类型（如AT2细胞）。尽管不同方案在时间尺度、添加剂浓度及培养维度上存在差异，但均能诱导产生多种肺上皮细胞类型的组合。除生化信号外，胚胎肺上皮还可感知并响应机械力，表明机械生态位在肺发育中发挥关键作用。上皮细胞通过关键的层粘连蛋白结合整合素α3β1、α6β1和α6β4与邻近基底膜相互作用，上皮细胞特异性缺失α3整合素会导致上皮分化缺陷。整合素介导的机械信号通过细胞骨架张力及与Hippo通路效应因子Yap的协同作用，间接调控细胞命运；肺上皮中Yap缺失会导致严重的形态发生缺陷及AT1细胞分化受阻。此外，肺可通过机械敏感离子通道Piezo1和Piezo2感知液体体积变化并启动信号应答。
目前关于肺间质细胞特化与分化及其在肺上皮发育中作用的研究，在小鼠中仍有限，在人类中尚属空白。但近期研究开始揭示这一机械生态位的关键细胞组分如何在体外调控上皮细胞的命运。例如，利用Tbx4肺增强子报告小鼠的iPSCs，可通过定向分化获得肺间质祖细胞；将这些体外分化的肺间质细胞与非肺上皮祖细胞共培养，可诱导后者获得肺上皮命运——共培养7天后，超过80%的原本Nkx2-1mCherry阴性细胞表达mCherry；将该间质细胞与E12.5小鼠胚胎原代肺上皮细胞共培养，较单独上皮培养可提高Nkx2-1GFP阳性上皮细胞的产量。类似地，人PSC来源的肺祖细胞与人胚胎肺成纤维细胞进行间接或直接共培养，均可促进其在三维（3D）培养中向AT2细胞分化。这些发现凸显了局部微环境中间质细胞对肺祖细胞特化及成熟肺上皮细胞分化的重要调控作用。
内皮细胞作为间质常驻细胞，对发育与疾病过程具有重要影响，尤其对于肺这类高度血管化的器官而言。尽管肺培养模型常缺乏整合的内皮组分，但近期研究已成功引入生态位的内皮组分以评估其对肺上皮细胞的影响。将7-9日龄大鼠幼崽分离的AT2细胞与内皮细胞及成纤维细胞共培养，可促进AT2细胞的分化表型，包括表面活性蛋白的表达与板层小体的形成，并改善上皮组织形成肺泡样结构的能力。近期一项研究开发了将幼年小鼠内皮细胞微注射入已分化的支气管肺泡肺类器官的方法，使内皮网络整合于肺泡样结构周围；若在内皮细胞分离阶段即将其加入支气管肺泡干细胞的初始悬液中，则几乎无法在形成的类器官周围检测到内皮细胞。这些结果表明，模拟机械生态位的更复杂的细胞组成，可改善肺上皮细胞的分化，并支持更具生理相关性的类器官结构，包括肺泡样结构的血管化。
肺微环境中ECM的作用
ECM是机械生态位的核心组分，其成分在胎儿期、新生儿期及成人期，以及不同解剖部位之间存在差异，随时间的推移调控驻留细胞的形态、迁移与分化。肺中丰度最高的ECM蛋白为胶原和弹性蛋白：人胎儿肺组织的胸膜与肺泡隔中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量高于成人组织；其他ECM组分还包括糖胺聚糖（如透明质酸HA）、蛋白聚糖、层粘连蛋白和纤连蛋白。不同发育阶段还会表达特定ECM组分的异构体，例如小鼠胚胎与成年肺中层粘连蛋白γ链的组合存在差异。肺ECM的刚度与器官的生物力学特性直接相关：纤维状ECM蛋白（如胶原和纤连蛋白）赋予肺抗张强度，而弹性蛋白则提供弹性回缩力。正常成人肺组织的杨氏模量因测量区域而异，介于0.44至7.5 kPa之间，平均为1.96 kPa；通过二维剪切波弹性成像观察到，妊娠24至39周期间人胎儿肺的平均弹性介于4至5 kPa之间，提示肺刚度随发育进程发生动态变化，与生态位ECM组成的改变相一致。
近期研究利用ECM来源的水凝胶模拟天然肺组织生态位的生化与机械特征。在人iPSCs经二维定向分化为AFE后，将肺祖细胞包封于由Matrigel与HA（肺ECM关键组分，天然Matrigel中缺乏）组成的混合水凝胶中，可加速含有细支气管与肺泡上皮细胞的均匀尺寸类器官的形成与成熟。另一研究中，将人iPSC来源的肺祖细胞接种于Matrigel中，置于Flexcell板上培养以模拟胎儿呼吸运动，对远端生态位施加周期性机械应变；与静态对照相比，拉伸培养的类器官在形态、大小、增殖及上皮谱系标志物表达上无显著差异，但含有更多AT2样细胞，这与肺发育后期肺泡周围生态位的力学变化一致。然而，Matrigel源自小鼠肉瘤，存在显著的批次间差异，会影响重现性。为克服这一问题，研究人员探索了更接近肺特异性ECM的替代策略：来自无肺病史患者的人肺脱细胞水凝胶保留了肺泡ECM的关键组分，可促进iPSC来源的AT2细胞增殖并形成肺泡球，但部分细胞会转分化为AT1样细胞；将人ESC来源的DE细胞在脱细胞羊肺ECM包被的培养板上进行分步分化，较纤连蛋白包被板可获得更成熟的肺上皮细胞（包括AT2细胞和纤毛细胞），3D培养条件可进一步提高成熟肺细胞的产量。这些结果证明，整合机械生态位的ECM组成与3D特性，可有效增强体外肺上皮细胞的定向分化与成熟。
纯合成水凝胶用于构建明确微环境并研究力学刚度对肺细胞分化的影响仍处于起步阶段。近期研究已在无Matrigel的降冰片烯修饰HA水凝胶中成功扩增人iPSC来源的AT2细胞并诱导其自组装为肺泡球，但这些AT2细胞最初是在Matrigel中从iPSC来源的肺祖细胞分化获得的。更近期的研究将人iPSCs在聚乙二醇降冰片烯（PEGNB）水凝胶上培养并进行分化，该水凝胶结合了蛋白酶可降解肽与细胞黏附肽；在这一完全合成体系中，软水凝胶（约4 kPa）比较硬水凝胶（约19 kPa）或Matrigel包被板可产生更高比例的NKX2-1阳性肺祖细胞。这表明纯合成水凝胶可通过模拟机械生态位的刚度，优化肺祖细胞的扩增与特化。
微环境物理因素的影响
除ECM蛋白外，肺微环境还以氧浓度与流体压力为特征，二者在肺发育中发挥关键作用。胎儿肺的氧浓度低于成熟肺，并随胎儿发育逐渐升高，为出生后空气呼吸做准备。肺发育早期，气道上皮向管腔分泌液体，对闭合的胎儿喉部产生正压，这种液体扩张肺组织并提供局部机械信号，促进肺形态发生与成熟。与此一致的是，按照分步方案将人iPSCs分化为成熟肺类器官时，若微环境模拟肺的氧含量与压力，可转录上调AT1和AT2细胞命运的关键标志物，并观察到分支增加及细胞分布更接近远端肺的结构特征。
无论培养维度如何，静态细胞培养会限制氧气与营养物质向细胞的传输，导致细胞生长减缓。例如，人iPSC来源的拟胚体（EBs）在搅拌式生物反应器中大量分化为具有分支与出芽特征的肺类器官，较静态系统获得的类器官体积更大；单细胞RNA测序证实，静态与搅拌培养系统生成的类器官均表达气道与肺泡上皮的经典标志物，二者无显著差异，但两种系统中存在的间质细胞及间质祖细胞类型不同，提示局部生态位的传质特性可能对维持这些细胞至关重要。另一项研究将人iPSCs包封于海藻酸水凝胶珠中进行分化，海藻酸的半透性允许氧气与营养物质扩散至包封细胞，并排出代谢废物；包封细胞在高长径比容器（HARV）旋转细胞培养微重力生物反应器中培养，该系统可产生层流，在最小化对水凝胶珠机械应力的同时，提供充足的传质与氧合；在此条件下分步分化为AT2细胞，可显著提高细胞增殖速率并加快分化进程。这些结果表明，动态培养系统通过模拟局部生态位的机械特征并克服静态培养常见的传质限制，可改善肺类器官的增殖、分化及细胞组成。
结论
目前已开展多项检测，以评估整合生化与机械生态位不同方面对分化方案效率的影响。常用检测方法包括免疫荧光与qPCR，用于确认和定量Nkx2-1等肺上皮标志物的表达，以及透射电子显微镜观察分化AT2细胞中板层小体的存在。此外，将荧光标签与Nkx2-1或表面活性蛋白C（SFTPC，AT2细胞标志物）等相关基因融合，也被用于在不同分化阶段鉴定和分离正确谱系。截至目前，祖细胞分化方案尚未实现100%的肺上皮细胞产出，分化产物中可能混有中胚层祖细胞等非上皮谱系。
研究人员对人iPSC来源的肺祖细胞向AT2细胞分化的过程进行了时间序列单细胞RNA测序分析，以解析PSC定向分化相关的表达动力学、命运轨迹与细胞可塑性，并将这些数据与原代发育中胎儿及成人肺细胞的大块RNA测序发育转录组动力学进行比较。分析结果显示，仅有一部分PSC来源的NKX2-1阳性肺祖细胞在向AT2细胞分化过程中维持细胞命运，其余细胞则产生非肺内胚层细胞命运。研究人员预期，整合上述微环境信号将显著提升PSC来源祖细胞向不同肺细胞类型分化的方案效率。
