《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Simultaneous molecular detection of Mycobacterium tuberculosis and multidrug resistance using CRISPR-AaCas12b-based nucleic acid assay
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为解决结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）快速精准诊断的临床缺口，研究人员开发并验证了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列及其
为解决结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）快速精准诊断的临床缺口，研究人员开发并验证了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein，CRISPR-Cas）的诊断检测方法。该研究建立了多重重组酶聚合酶扩增（multiplex-recombinase polymerase amplification，RPA）偶联CRISPR-酸嗜热菌（Alicyclobacillus acidiphilus）Cas12b（AaCas12b）的检测体系，可同步靶向MTB特异性插入序列IS6110，以及利福平耐药核心突变位点rpoB 1349C>T与异烟肼耐药核心突变位点katG 944G>C。该体系支持荧光平台与侧向层析色谱（lateral flow chromatography，LFC）双模式信号读取。研究人员以世界卫生组织推荐的GeneXpert MTB/RIF、表型药物敏感性试验（phenotypic drug susceptibility testing，pDST）及测序结果为参考标准，在48份临床样本中完成了诊断性能评估。结果显示，针对MTB检测，该多重RPA-CRISPR-AaCas12b体系的检测限（limit of detection，LoD）达1.5 CFU/mL，以培养结果为金标准时灵敏度为97.1%、特异度为100%，总周转时间为30分钟（RPA扩增20分钟，CRISPR切割10分钟）。针对MDR-TB相关突变，以测序为参考标准，该体系对rpoB 1349C>T突变的灵敏度为94.1%、特异度为100%；对katG 944G>C突变的灵敏度为94.7%、特异度为93.1%。值得注意的是，整合LFC的体系在保持相当诊断准确率的同时，总周转时间为35分钟（RPA扩增20分钟，CRISPR切割5分钟，层析条带判读10分钟）。研究人员认为，该体系实现了MTB及常见MDR-TB相关突变的简便、精准、高灵敏度检测，其流程快速简化且资源需求低，在资源有限地区的即时检测（point-of-care testing，POCT）中具有广阔应用潜力，将有助于加强结核病及耐药结核病的监测与控制。
本研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》，聚焦于解决结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）在基层诊疗场景中难以实现快速精准同步检测的难题。当前，传统分枝杆菌培养法虽为活动性结核病诊断的金标准，但依赖长周期孵育且灵敏度有限，难以满足临床常规需求；以实时荧光定量PCR为代表的核酸技术虽提升了检测速度与性能，但大多依赖精密仪器与专业人员，在低资源、高负担地区推广受限。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein，CRISPR-Cas）系统凭借无需专用实验室基础设施的特性，成为病原体核酸快速检测的新兴平台，但在结核病领域，现有CRISPR检测多仅针对MTB单独检测或单药耐药筛查，缺乏可同步识别MTB与关键利福平、异烟肼耐药突变的一体化工具，且多数仍处于概念验证阶段，亟需进一步的临床验证。针对上述瓶颈，研究人员开发了基于CRISPR-酸嗜热菌（Alicyclobacillus acidiphilus）Cas12b（AaCas12b）的同步检测策略，旨在填补这一临床空白。
在开展研究过程中，研究人员采用了多重重组酶聚合酶扩增（multiplex-recombinase polymerase amplification，RPA）与CRISPR-AaCas12b偶联的核心技术路线，设计了靶向MTB特异性插入序列IS6110、利福平耐药关键突变rpoB 1349C>T及异烟肼耐药关键突变katG 944G>C的单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），并通过引入人工错配（introduction of deliberate mismatches，IDM）策略优化sgRNA的突变特异性。研究共纳入48份经临床常规结核病检测预处理后的剩余痰或支气管肺泡灌洗液样本，涵盖药物敏感结核病、耐药结核病、非结核分枝杆菌感染及其他非分枝杆菌感染四类，所有样本均经去标识化处理，符合伦理规范。
研究结果部分，首先完成了功能性AaCas12b蛋白的表达与纯化，通过镍柱亲和层析成功获得高纯度蛋白，并经后续实验验证了核酸酶活性。随后，研究人员建立了针对IS6110、rpoB及katG基因的多重RPA扩增体系，经琼脂糖凝胶电泳验证，该体系对MTB H37Rv菌株的检测限达1.5 CFU/mL，可实现三靶标的高效同步扩增。在CRISPR-AaCas12b检测性能评估中，针对MTB的IS6110靶标，体系检测限同样为1.5 CFU/mL，且与其他分枝杆菌及常见呼吸道病原体无交叉反应，展现出高分析特异性。针对MDR-TB突变检测，研究人员通过sgRNA长度调控、PAM（protospacer adjacent motif，原型间隔序列邻近基序）筛选及IDM策略，成功实现对rpoB 1349C>T与katG 944G>C突变的高特异性识别：针对rpoB 1349C>T，20 nt sgRNA经13、14位错配优化后，可显著区分突变型与野生型模板；针对katG 944G>C，通过切换至非经典PAM并优化19 nt sgRNA的7、8位错配，实现了对突变型的特异性切割且无野生型非特异性活性。临床样本验证显示，以培养为参考标准，该体系对MTB的检测灵敏度为97.1%、特异度为100%，与GeneXpert结果一致；以测序为参考标准，对rpoB 1349C>T突变的检测灵敏度为94.1%、特异度为100%，对katG 944G>C突变的检测灵敏度为94.7%、特异度为93.1%。进一步整合侧向层析色谱（lateral flow chromatography，LFC）的便携式检测模式，在保持高准确率的同时，将结果转化为可视化的定性条带，适配无高级检测仪器的场景，其对MTB、rpoB 1349C>T及katG 944G>C突变的检测性能与荧光模式相当。
讨论部分指出，相较于现有CRISPR结核病检测技术，该研究体系流程简化、总耗时仅30至35分钟，采用商业化LFC试纸条与通用荧光报告系统实现双模式输出，无需复杂前处理或辅助操作，在操作便捷性与可及性上实现了平衡，契合资源有限地区MDR-TB筛查的实际需求。同时，研究也存在局限性：临床样本量较小，可能影响结果的普适性；仅覆盖两种代表性耐药突变，检测谱较全测序方法窄；当前流程为分步操作，未实现全封闭管式一体化，存在操作复杂度与交叉污染风险。研究人员计划在未来扩大临床样本队列、拓展耐药突变检测范围、结合人工智能优化检测系统设计，并推进全流程封闭管式一体化升级，以进一步提升临床转化价值。
结论部分表明，该CRISPR-AaCas12b双模式检测体系集成了多重检测、高特异性与操作便捷的核心优势，通过荧光与LFC双模式实现了MTB与耐药突变的同步检测，有望作为世界卫生组织“终结结核病战略”的重要支撑工具，为耐药结核病筛查提供快速、精准、可及的即时检测（point-of-care testing，POCT）解决方案。
