《Frontiers in Microbiology》：Fungal endophytes associated with Inca nut plants (Plukenetia volubilis L.) in China and Thailand and their plant growth promoting properties
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内生真菌因其在促进植物生长及农业应用中的潜在价值而受到日益关注。本研究旨在分离、鉴定并评估采自中国云南省红河州及泰国清迈府芳县与清道县的健康印加果（Plukenetia volubilis L.）叶片中内生真菌的促生长潜力。研究人员共获得168株真菌，隶属于3
内生真菌因其在促进植物生长及农业应用中的潜在价值而受到日益关注。本研究旨在分离、鉴定并评估采自中国云南省红河州及泰国清迈府芳县与清道县的健康印加果（Plukenetia volubilis L.）叶片中内生真菌的促生长潜力。研究人员共获得168株真菌，隶属于35个已知属及1个未识别属，其中子囊菌门（Ascomycota）占绝对优势，达166株（98.8%）。结果表明，红河采样点的菌株数量最多。研究人员采用内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）作为分子标记进行真菌鉴定。Nigrospora属与Cercospora属分别为红河与清道采样点的优势属，而Hypoxylon属则是芳县采样点的优势属。Colletotrichum属与Pseudopithomyces属在所有三个采样点均有分布。在促生长特性测定中，共有96株菌显示产铁载体（siderophore）阳性，47株菌可溶解不溶性磷酸盐。此外，13株真菌可产生吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA），其中Colletotrichum属菌株1-8-1的产量最高，达470.00 μg mL?1。产纤维素酶与几丁质酶的菌株分别有57株和10株。进一步研究发现，含有IAA的Colletotrichum属菌株1-1-6、1-8-1和2-1-15的发酵滤液能显著增强芥蓝（Chinese kale）与番茄的种子萌发率。在幼苗生长试验中，菌株1-8-1的发酵滤液亦显著增加了两种作物的根长与株高。这是首次对中国及泰国印加果内生真菌进行的系统性报道，为挖掘印加果有益内生真菌资源及其在农业促生领域的应用提供了重要依据。
研究背景
印加果（Plukenetia volubilis L.）又称星油藤或印加花生，是大戟科（Euphorbiaceae）多年生攀援油料作物，原产于南美洲亚马逊雨林。其种子富含α-亚麻酸和γ-亚麻酸等高价值必需脂肪酸，在食品、医药及化妆品领域具有广阔应用前景。随着全球对可持续农业及减少化学肥料依赖的需求增加，植物内生菌因其促进宿主生长、增强抗逆性及生物防治功能成为研究热点。尽管已有关于印加果丛枝菌根真菌及根际土壤真菌的研究，但目前针对中国及泰国种植区印加果叶片内生真菌的多样性及其促生机制仍缺乏系统性调查。因此，研究人员开展此项研究，旨在阐明不同地区印加果内生真菌的群落组成，并评估其作为潜在微生物肥料的应用价值。本论文发表于《Frontiers in Microbiology》。
主要技术方法
研究人员于2021年3月和2022年3月在中国云南红河（海拔550 m）及泰国清迈的清道（海拔500 m）和芳县（海拔1000 m）三个地点采集健康印加果叶片。采用分层随机采样法，每个地点选取10株植株，每株采集不同冠层的10片叶。内生真菌通过表面消毒后于马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar, PDA）培养基上分离纯化。利用真菌核糖体DNA的内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）作为分子标记，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增及测序进行物种鉴定。采用Chrome Azurol S（CAS）平板法检测铁载体产生能力，Pikovskaya（PVK）平板法检测溶磷能力，Salkowski比色法结合高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）定量检测吲哚-3-乙酸（IAA）产量，并通过纤维素和胶体几丁质平板法评估胞外酶活性。最后，研究人员将含有IAA的真菌发酵滤液稀释至25 μg mL?1，用于芥蓝和番茄的种子萌发及幼苗生长试验。
研究结果
3.1 内生真菌的分离、初步鉴定及组成
研究人员从三个地点共分离得到168株内生真菌，其中清道（Site 1）71株，芳县（Site 2）51株，红河（Site 3）46株。基于ITS序列分析，除1株未识别属外，其余167株被归类为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）共35个属。子囊菌门占绝对优势（166株）。优势属依次为Cercospora（19.6%）、Colletotrichum（14.9%）、Diaporthe（7.7%）和Hypoxylon（7.1%）。红河采样点的属级多样性最高（21属），且Nigrospora为该地优势属；清道以Cercospora为主；芳县则以Hypoxylon为主。Colletotrichum和Pseudopithomyces是两个在所有采样点均存在的共有属。
3.2 植物促生长特性的测定
在促生特性方面，96株（57.1%）真菌表现出产铁载体能力，其中Fusarium sp. IN37的活性最强。47株（28.0%）真菌具有溶磷能力，以Cercospora sp. 1-7-1的活性最高。13株（7.7%）真菌能够合成IAA，产量范围为2.58至470.00 μg mL?1，其中Colletotrichum sp. 1-8-1的产量最高。此外，57株（33.9%）真菌产纤维素酶，10株（6.0%）真菌产几丁质酶，分别以Hypoxylon sp. 2-2-5和Nigrospora sp. IN41的酶活性最高。
3.3 含IAA真菌发酵滤液的促生效应
选取产IAA最高的三株Colletotrichum（1-1-6, 1-8-1, 2-1-15）进行生物测定。结果显示，三种发酵滤液均能显著提高芥蓝种子的萌发指数（Germination Index, GI），其中菌株1-8-1的效果最佳。对于番茄种子，发酵滤液处理的GI值虽与纯IAA无显著差异，但显著高于无菌水和培养基对照。在幼苗生长试验中，菌株1-8-1的发酵滤液显著促进了芥蓝和番茄的根长及株高，其促生效果与纯IAA相当甚至优于纯IAA。
讨论与结论
讨论部分指出，该研究首次揭示了中国及泰国印加果内生真菌群落以子囊菌门为主，且地理分布差异显著，这与秘鲁地区的群落结构明显不同，证实了地理环境对内生菌群组装的影响。研究人员发现，Colletotrichum、Nigrospora和Hypoxylon等属不仅丰度高，且兼具产IAA、铁载体、溶磷及分泌细胞壁降解酶等多种促生功能，表明这些类群在宿主植物营养吸收和健康维持中扮演重要角色。特别是Colletotrichum sp. 1-8-1表现出极强的产IAA能力和促生潜力，是具有开发前景的微生物肥料候选菌株。
结论
本研究首次系统报道了中国及泰国印加果叶片的内生真菌多样性。研究人员从健康叶片中分离鉴定了168株真菌，隶属于36个分类单元，子囊菌门占据主导地位。不同地理种群的优势属存在差异，但Colletotrichum和Pseudopithomyces为共有优势属。功能测定表明，超过半数的菌株具有产铁载体能力，近三分之一具有产纤维素酶能力，且筛选到了高产IAA的菌株。生物测定证实，Colletotrichum sp. 1-8-1的发酵滤液能显著促进十字花科和茄科作物的早期生长。该研究不仅丰富了印加果微生态学数据，也为开发新型、环境友好的微生物接种剂（Microbial inoculants）提供了重要的菌种资源和应用理论基础。
