《Stem Cell Research & Therapy》：Variable cMyBP-C expression from cell to cell in a MYBPC3c.927–2 A>G hiPSC-CM model recapitulates HCM patient phenotype
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肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy, HCM）常与心肌肌球蛋白结合蛋白C（cardiac myosin binding protein C, cMyBP-C；基因名MYBPC3）突变及cMyBP-C半合子不足相关。此前研究人员
肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy, HCM）常与心肌肌球蛋白结合蛋白C（cardiac myosin binding protein C, cMyBP-C；基因名MYBPC3）突变及cMyBP-C半合子不足相关。此前研究人员在HCM患者心肌中发现MYBPC3呈爆发式转录，且野生型cMyBP-C在不同心肌细胞间的表达量不均一。本研究构建了携带患者特异性杂合MYBPC3 c.927–2 A>G剪接位点突变的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）模型及同基因对照，旨在长期培养中验证体外是否存在与患者心肌相似的病理生理特征。研究人员评估了cMyBP-C蛋白表达、转录动态、收缩功能及钙处理能力，并将细胞表型与患者心肌组织进行比对。蛋白质免疫印迹证实突变型hiPSC-CMs存在cMyBP-C半合子不足；免疫染色显示突变型细胞中肌原纤维排列紊乱，且cMyBP-C阴性心肌细胞比例随时间升高，与患者在体心肌的cMyBP-C表达异质性一致；RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization, RNA-FISH）揭示MYBPC3转录呈细胞间差异，可能是cMyBP-C表达异质性的来源；突变型细胞的收缩缩短速度随时间减慢，而钙瞬变动力学加速；转录组学分析显示收缩、钙处理及HCM相关通路失调。该hiPSC模型成功复现了患者心肌的蛋白表达变异性和功能表型，支持单细胞转录变异性在HCM发病中的作用，可为后续机制研究与药物筛选提供平台。
研究背景与意义
肥厚型心肌病是一种常见的遗传性心肌病，全球人群患病率约为1:500至1:200，主要病理特征包括左心室肥厚、舒张功能障碍及心肌细胞与肌原纤维排列紊乱，是青少年及运动员心源性猝死的重要病因之一。约半数HCM患者存在肌节蛋白编码基因突变，其中近40%的突变位于MYBPC3基因，该基因编码的cMyBP-C是心肌粗丝的关键调节蛋白，其突变多导致截短蛋白产生并通过无义介导的mRNA降解被清除，最终引发cMyBP-C半合子不足。近年研究发现，MYBPC3在健康与病变心肌中均存在爆发式转录现象，即转录过程并非连续进行，而是以随机爆发的模式发生，这种特性在杂合突变背景下会导致不同心肌细胞间的野生型cMyBP-C表达量出现显著差异，进而引起细胞间收缩功能的不平衡，被认为是HCM发病机制中的重要环节。然而，这一细胞水平的异质性特征是否在体外细胞模型中稳定存在，以及其随培养时间的演变规律尚不清楚。针对上述问题，研究人员构建了携带MYBPC3 c.927–2 A>G剪接位点突变的患者特异性hiPSC-CMs模型，通过与同基因对照的长期比对分析，系统验证了该模型对患者在体病理特征的复现能力，为解析HCM的细胞起源与进展机制提供了可靠平台。该研究发表于《Stem Cell Research》。
关键技术方法
研究采用CRISPR/Cas9技术将患者来源的MYBPC3 c.927–2 A>G杂合突变引入健康供体hiPSC系，同时获得经相同编辑流程但未引入致病突变的同基因对照克隆，所有细胞系均经过核型、多能性标记及基因组稳定性验证。hiPSC在化学成分明确的悬浮培养体系中定向分化为心肌细胞，分化效率经流式细胞术检测超过95%。长期培养过程中，研究人员综合运用蛋白质免疫印迹定量总cMyBP-C水平，免疫荧光染色评估单细胞水平的cMyBP-C表达分布与肌原纤维形态，RNA-FISH可视化单个细胞核内的MYBPC3活跃转录位点，视频光学边缘检测技术分析单细胞收缩动力学，Fura-2 AM钙成像检测胞内钙瞬变参数，并结合mRNA测序与通路富集分析解析转录组层面的变化。
研究结果
cMyBP-C表达与MYBPC3转录活性
蛋白质免疫印迹结果显示，突变型hiPSC-CMs在培养第35天与70+天分别出现约25%与30%的cMyBP-C总量下降，第56天水平与对照无显著差异，总体符合半合子不足特征。RNA-FISH分析表明，突变型与对照细胞均存在MYBPC3爆发式转录，表现为部分细胞核无活跃转录位点、部分仅含单个位点；但突变型细胞的平均活跃转录位点数在各时间点均高于对照，提示存在代偿性转录上调。免疫荧光染色进一步发现，突变型细胞中cMyBP-C阴性细胞的比例从第35天的4%逐渐升至第70+天的40%，且始终约为对照组的2倍，证实了cMyBP-C表达的细胞间异质性随培养时间加剧。
形态学特征与肌原纤维排列紊乱
突变型与对照细胞的细胞面积随培养时间均增大且无组间差异，但突变型细胞在第70+天时长宽比显著降低，提示细胞形态更趋圆形；同时肌原纤维排列评分显著低于对照，表明存在明显的肌原纤维排列紊乱，与HCM患者的组织病理学特征一致。
c.927–2 A>G突变对收缩动力学与钙瞬变的影响
收缩功能分析显示，突变型细胞在第56天出现收缩达峰时间延长、半松弛时间延长及收缩幅度与最大缩短速度下降，第70+天时缩短速度与幅度的降低仍持续存在，且集群细胞的收缩速度下降较单个细胞更为显著。钙成像结果显示，突变型细胞在第35天钙瞬变达峰时间与半衰减时间缩短、振幅升高，第70+天时振幅转为低于对照，提示钙处理功能随培养时间发生动态改变。
mRNA测序与基因集富集分析
转录组学分析显示，第35天下调通路显著富集于HCM相关通路，第70+天时HCM、扩张型心肌病、钙信号通路及心肌收缩通路均显著上调。差异基因分析表明，第70+天时肌节相关基因MYL2、MYH6、MYL3及肌节组装基因TCAP、DES显著上调，钙处理基因ATP2A2、HRC、KCNJ2、SCN5A上调而CASQ2下调，提示长期培养中细胞出现了广泛的代偿性转录重塑。
讨论与结论
研究结果表明，MYBPC3 c.927–2 A>G突变hiPSC-CMs模型在长期培养中稳定复现了患者心肌的核心表型：cMyBP-C半合子不足、爆发式转录导致的细胞间表达异质性、肌原纤维排列紊乱及收缩与钙处理功能异常。cMyBP-C阴性细胞比例的进行性升高提示，单纯批量蛋白检测可能低估突变带来的表达失衡，单细胞水平的异质性才是HCM的重要病理特征。突变型细胞转录活性的代偿性上调不足以抵消表达异质性，且伴随肌节结构与钙处理通路的广泛重塑，这与患者在体组织的分子特征高度一致。该模型的建立不仅验证了单细胞转录变异性在HCM发病中的关键作用，也为后续靶向干预研究提供了可靠的体外平台。研究人员指出，该模型可进一步用于解析cMyBP-C剂量失衡与心肌细胞功能损伤的因果关系，并支撑个体化治疗策略的开发。
